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川续断β-香树脂醇合酶的基因克隆及生物信息学分析

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中国中药杂志 2022年第17期47卷 4593-4599页

作者：姚魏琳潘杰牛腾飞杨小林赵淑娟王峥涛王如锋上海中医药大学中药研究所上海201203 上海中医药大学中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室上海201203 上海中药标准化研究中心上海201203 上海中医药大学中药标准化教育部重点实验室上海201203

续断是我国常用中药材之一,药用历史悠久,具有补肝肾、强筋骨、续折伤等功效。三萜皂苷类化合物是川续断科植物川续断的主要药效成分。β-香树脂醇合酶(β-AS)属于氧化角鲨烯环化酶(OSCs)超家族,在生物合成途径中具有催化齐墩果烷型三... 详细信息

续断是我国常用中药材之一,药用历史悠久,具有补肝肾、强筋骨、续折伤等功效。三萜皂苷类化合物是川续断科植物川续断的主要药效成分。β-香树脂醇合酶(β-AS)属于氧化角鲨烯环化酶(OSCs)超家族,在生物合成途径中具有催化齐墩果烷型三萜皂苷骨架形成的功能。目前有关川续断β-香树脂醇合酶的研究较少,其催化机制仍待探究。为进一步挖掘与丰富该类酶的信息,该研究通过对转录组测序结果进行分析,从川续断中克隆得到1个β-香树脂醇合酶基因DaWβ-AS,并构建至大肠杆菌载体中实现蛋白表达;并采用实时荧光定量PCR技术分析其在川续断4个不同组织中的相对表达量,结果显示DaWβ-AS基因在叶中的相对表达量最高。生物信息学分析表明,DaWβ-AS蛋白含有PLN03012保守结构域,属于cl31551超家族,无跨膜区且不含信号肽。通过对川续断β-AS的克隆、表达及生物信息学分析,为川续断三萜皂苷生物途径解析提供了科学依据,有助于推动后期川续断三萜皂苷的定向生物合成,并为高质量川续断资源培育与开发提供相关参考。

关键词：川续断三萜皂苷 β-香树脂醇合酶基因克隆生物信息学

灰毡毛忍冬CHI和CHS基因的克隆及功能研究

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中国中药杂志 2022年第9期47卷 2419-2429页

作者：曾娟龙雨青李灿曾梅杨敏周新茹刘湘丹周日宝湖南中医药大学药学院湖南长沙410208 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室湖南长沙410208 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室湖南长沙410208

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,... 详细信息

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,HPLC测定木犀草苷含量并结合表达量做相关性分析。结果显示,灰毡毛忍冬2个品种中CHI、CHS基因,分别包含627、1170 bp的ORF区,且CHI蛋白和CHS蛋白均为稳定、带亲水性的非分泌型蛋白。qRT-PCR结果表明2个品种CHI、CHS基因在不同花发育阶段及茎、叶中均有差异表达,且在关键花期表达差异明显,结合HPLC数据,木犀草苷含量与基因相对表达量之间呈现负相关性。推测灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因参与调控黄酮化合物的累积,可进一步进行其功能研究。该研究首次克隆了灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因并进行表达分析,丰富了灰毡毛忍冬黄酮生物合成研究,为进一步探究灰毡毛忍冬中木犀草苷等黄酮类成分差异的分子机制以及良种选育提供研究基础。

关键词：灰毡毛忍冬查尔酮异构酶查尔酮合成酶基因克隆表达分析含量测定

沙门氏菌噬菌体SM-p2内溶酶及穿孔素的生物信息学分析和克隆表达

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中国食品学报 2022年第8期22卷 32-39页

作者：戚斌解天慧石慧西南大学食品科学学院重庆400715

沙门氏菌是常见的危害公共安全的食源性致病菌。内溶酶和穿孔素作为新型生物抑菌剂,是噬菌体编码的具有细菌裂解作用的功能蛋白。本文利用十聚寡核苷酸引物和PCR技术对噬菌体SM-p2的DNA进行随机扩增并确定穿孔素基因Hol 2和内溶酶基因Ly... 详细信息

沙门氏菌是常见的危害公共安全的食源性致病菌。内溶酶和穿孔素作为新型生物抑菌剂,是噬菌体编码的具有细菌裂解作用的功能蛋白。本文利用十聚寡核苷酸引物和PCR技术对噬菌体SM-p2的DNA进行随机扩增并确定穿孔素基因Hol 2和内溶酶基因Lys 2;使用生物学信息软件分析预测Lys 2和Hol 2的特性;利用大肠杆菌原核表达系统对Lys 2和Hol 2进行克隆表达。结果表明:噬菌体SM-p2是一种具有“穿孔素-内溶酶”裂解体系的双链DNA烈性噬菌体。经生物信息学分析发现,Hol 2是一种仅有一个跨膜结构的Ⅲ型穿孔素,Lys 2是一种没有跨膜结构肽聚糖水解酶。利用大肠杆菌表达系统成功表达了Lys 2和Hol 2,然而,穿孔素能直接裂解细菌细胞内膜,对感受态表达细胞产生毒害作用,导致Hol 2表达量较少。最终获得质量浓度为5.419 mg/mL的内溶酶Lys 2和2.191 mg/mL的穿孔素Hol 2。本研究成功表达了沙门氏菌噬菌体SM-p2的内溶酶和穿孔素,为SM-p2的抑菌研究奠定了分子基础。

关键词：噬菌体基因克隆内溶酶穿孔素

丹参Sm14-3-3蛋白基因克隆、诱导模式及原核表达分析

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中国中药杂志 2022年第18期47卷 4886-4894页

作者：时晨晶王世威彭佳铭许海玉天津中医药大学天津301617 广东药科大学中药学院广东广州510006 安徽中医药大学药学院安徽合肥230012 中国中医科学院中药研究所北京100700

14-3-3蛋白是植物体内一类重要的调控蛋白,对植物的生长发育及生物和非生物胁迫都具有重要的调控作用。该研究利用酵母双杂交从药用植物丹参cDNA文库中筛选并克隆到1个编码14-3-3蛋白基因(GenBank登录号为OM683281),该基因开放阅读框(O... 详细信息

14-3-3蛋白是植物体内一类重要的调控蛋白,对植物的生长发育及生物和非生物胁迫都具有重要的调控作用。该研究利用酵母双杂交从药用植物丹参cDNA文库中筛选并克隆到1个编码14-3-3蛋白基因(GenBank登录号为OM683281),该基因开放阅读框(ORF)由780 bp组成,编码259个氨基酸。生物信息学分析预测该蛋白的分子式为C_(1287)H_(2046)N_(346)O_(422)S_(9),相对分子质量29.4 kDa,不含信号肽,为非跨膜蛋白。通过基因同源序列比对及进化树分析,证明该基因确实属于14-3-3蛋白家族,与拟南芥、水稻中的14-3-3蛋白基因家族亲缘关系较近。将丹参14-3-3基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,在大肠杆菌BL21中,成功表达出重组蛋白。实时荧光定量PCR检测,确定该基因在丹参根、茎、叶、花不同组织部位中表达,叶中表达量最高,茎中次之,花中的表达量最低。15%PEG模拟干旱、植物激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导丹参植株,14-3-3基因表达水平在诱导的早期出现峰值,表明该基因能够快速响应干旱等非生物胁迫和水杨酸、茉莉酸、乙烯等植物激素处理。为后续研究14-3-3蛋白调控丹参酮生物合成及响应生物和非生物胁迫的分子机制奠定基础。

关键词：丹参 14-3-3蛋白基因克隆原核表达诱导模式

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山羊ST13基因的克隆及表达特性分析

生物工程学报 2022年第8期38卷 2959-2973页

作者：王瑞龙李艳艳林亚秋陈定双盛雪晴赵楠刘伟西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室四川成都610041 西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041

本研究旨在克隆获取山羊ST13基因完整的蛋白质编码区(sequence coding for aminoacids in protein,CDS)序列,并对其进行表达特性分析,同时探究该基因在不同组织和诱导分化不同阶段的山羊皮下前体脂肪细胞中的表达规律。利用逆转录PCR(re... 详细信息

本研究旨在克隆获取山羊ST13基因完整的蛋白质编码区(sequence coding for aminoacids in protein,CDS)序列,并对其进行表达特性分析,同时探究该基因在不同组织和诱导分化不同阶段的山羊皮下前体脂肪细胞中的表达规律。利用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆ST13基因,利用在线工具和软件对该基因序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,qRT-PCR)技术检测其在山羊各个组织及皮下前体脂肪细胞不同分化阶段中的表达规律。克隆获得山羊ST13基因序列长度为1380 bp,其CDS区长度为1101 bp,共编码366个氨基酸;蛋白预测结果显示,ST13蛋白存在26个磷酸化位点,部分序列有强烈的亲水性和不稳定性,并且属于非跨膜和非分泌蛋白;亚细胞定位预测显示,ST13大部分分布在细胞核中,占69.6%;进化树显示,山羊ST13与绵羊的亲缘关系最近;组织表达谱显示,ST13基因在山羊心、肝、脾、肺、肾等13种组织中均有表达,尤其在臂三头肌和皮下脂肪中的表达量最高(P0.05);时序表达谱显示,该基因在诱导分化后的脂肪细胞中表达上调,在诱导分化第108小时表达最高,显著高于其他诱导分化时间段(P基因在山羊组织中广泛表达,对山羊皮下脂肪细胞分化过程有重要调控作用。

关键词：山羊 ST13基因基因克隆组织表达时序表达

大菱鲆源荧光假单胞菌群体感应淬灭酶基因的克隆及生物信息学分析

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中国食品学报 2022年第7期22卷 64-75页

作者：申悦崔方超李婷婷王当丰刘景云谭茜倩吕欣然励建荣渤海大学食品科学与工程学院生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013 大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600

导致水产品腐败变质的微生物之间存在一种信息交流机制,称之为群体感应。革兰氏阴性细菌群体感应系统主要由N-酰基高丝氨酸内酯作为信号分子,在水产品中间接调控一些腐败菌的致腐特性。可通过淬灭群体感应来抑制水产品的腐败。作为群体... 详细信息

导致水产品腐败变质的微生物之间存在一种信息交流机制,称之为群体感应。革兰氏阴性细菌群体感应系统主要由N-酰基高丝氨酸内酯作为信号分子,在水产品中间接调控一些腐败菌的致腐特性。可通过淬灭群体感应来抑制水产品的腐败。作为群体感应抑制剂的群体感应淬灭酶在许多细菌中被鉴定出来。为探究荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因表达产物的潜在功能,通过基因克隆和生物信息学分析对其进行研究。结果表明:荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因能编码一种群体感应淬灭酶,与铜绿假单胞菌PAO1的第2个高丝氨酸内酯酰化酶QuiP蛋白的相似性为65.82%。序列分析显示:pf-1240基因共编码795个氨基酸,蛋白分子式为C_(3867)H_(6010)N_(1084)O_(1160)S_(19),相对分子质量86855.96,理论等电点为7.81,不稳定系数为35.29,属于亲水蛋白。由保守结构域分析可知,该蛋白包含一个完整的青霉素酰化酶家族结构域且该家族中有许多酶被证实具有群体感应淬灭酶功能,能够分解长链群体感应信号分子AHLs。推测该蛋白也具有类似的群体感应淬灭酶功能。本研究借助生物信息学技术对其理化性质、结构等情况进行预测分析,以便深入了解荧光假单胞菌群体感应淬灭酶的性质和功能。

关键词：基因克隆群体感应 N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶生物信息学分析水产品腐败

云锦杜鹃苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及功能分析

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生物工程学报 2022年第1期38卷 374-385页

作者：吕思佳吴月燕贾永红何凡蒋宝鑫杨国霞谢晓鸿浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315100

苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase,PAL)是植物香气化合物中苯甲酸甲酯合成途径的关键酶。为探究云锦杜鹃Rhododendron fortunei RhPAL基因的功能,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆RhPAL基因全长cDNA序列,并应用高效液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)联用技术分析云锦杜鹃不同发育阶段的不同组织中RhPAL基因表达水平和代谢物含量变化关系。结果表明,从云锦杜鹃花cDNA中克隆得到RhPAL基因,含有完整的cDNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列长2145bp,编码715个氨基酸,与其他物种的PAL蛋白质氨基酸序列具有较高的同源性;qRT-PCR分析表明,在不同花期的花瓣中,RhPAL表达量呈上升趋势,在衰败期表达量最高,雌蕊的表达量远远高于雄蕊,同时,新叶高于老叶,叶片的表达量高于花瓣和花蕊。通过酶联检疫法检测分析云锦杜鹃不同花期的花瓣中PAL酶活性,在花苞期酶活性最高,衰败期最低,总体呈下降趋势。通过LC-MS技术,检测分析云锦杜鹃中苯丙氨酸(phenylalanine,L-Phe)和肉桂酸(cinnamic acid,Ca)的含量,发现在云锦杜鹃不同组织中苯丙氨酸和肉桂酸的含量变化趋势与RhPAL基因表达水平相一致,且均与RhPAL基因表达量呈高度相关。推测RhPAL在云锦杜鹃花香物质合成中发挥关键作用,本研究结果可为研究杜鹃花香气物质分子调控机制提供理论依据。

关键词：杜鹃高效液相色谱-质谱联用苯丙氨酸解氨酶基因克隆生物信息学分析肉桂酸

植物乳杆菌WU146-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表达及生物信息学分析

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中国食品学报 2022年第6期22卷 62-71页

作者：缪婷婷沈风飞张晓晓邱胡林徐波尹爱国石鹏君江西农业大学生物科学与工程学院南昌330045 广东石油化工学院生物与食品工程学院广东茂名525000 中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反... 详细信息

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)技术成功克隆了8个WU14的糖苷水解酶,生物信息学分析表明均为糖苷水解酶1家族(GH1)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。鉴于植物乳杆菌中该类糖苷酶鲜有报道,采用原核异源表达展开研究。序列分析表明8个酶蛋白氨基酸序列具有GH1家族的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶典型的2个保守催化位点,序列一致性在32%~74%之间。经SDS-PAGE,8个蛋白均在大肠杆菌中表达,其中BglAW14、BglCW14、BglFW14为部分可溶性表达,其余为蛋白表达,形成包涵体。生物信息学分析显示:8个基因的编码蛋白都无信号肽和跨膜结构,疏水性较强。由亚细胞定位预测可知,除BglEW14主要存在于分泌结构内和BglHW14主要存在于细胞膜外,其余6个基因都存于细胞质内。对8个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及生物学序列分析,为进一步探究植物乳杆菌来源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的分子机理研究奠定了基础。

关键词：植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因克隆蛋白表达生物信息学分析

穗醋栗MYB10基因克隆结构分析及功能验证

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生物工程学报 2022年第1期38卷 275-286页

作者：冯秋影刘学杨琳琳付泽元徐启江东北林业大学生命科学学院东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室黑龙江哈尔滨150040

为探究花色苷合成相关转录因子MYB10在不同颜色穗醋栗果实着色差异的分子机理,通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)法从果实花青素含量有较大差异的黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)、红穗醋栗(Ribes rubrum L.... 详细信息

为探究花色苷合成相关转录因子MYB10在不同颜色穗醋栗果实着色差异的分子机理,通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)法从果实花青素含量有较大差异的黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)、红穗醋栗(Ribes rubrum L.)和白穗醋栗(Ribes album L.)中分别克隆出MYB10基因,分别命名为RnMYB10 (KY786107)、RrMYB10 (KY786108)和RaMYB10(MW660848)。系统发育分析表明,RnMYB10和RrMYB10在进化上具有同源性。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)结果表明:黑穗醋栗各时期果实中MYB10表达量均高于红穗醋栗且远远高于白穗醋栗。随着果实直径加大颜色加深,RnMYB10和RrMYB10表达量呈现先上升后下降的趋势(在果实转色程度75%时达到最大值),RaMYB10表达量极低,几乎无表达。过表达RnMYB10和RrMYB10的拟南芥呈现紫色叶柄和叶片,过表达RaMYB10的拟南芥无明显变化。说明MYB10基因在穗醋栗果实呈色中发挥重要作用。

关键词：穗醋栗 MYB10 基因克隆表达量功能验证