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ABCA3基因定点突变及其在A549细胞株中的表达

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中国当代儿科杂志 2015年第4期17卷 395-399页

作者：王娟娟李媛陈春燕胡培静耿立蒙周熙惠西安交通大学医学院第一附属医院新生儿科/环境与疾病相关基因教育部重点实验室离子通道研究病室陕西西安710061

目的探讨构建与新生儿呼吸窘迫综合征相关的ABCA3基因突变体c.875A>T(p.E292V)和c.2169G>A(p.M723I)及其绿色荧光表达载体的方法,并观察其在人肺腺癌(A549)细胞株中的表达。方法应用重叠延伸PCR法构建ABCA3基因的两个突变体E292V和M723I... 详细信息

目的探讨构建与新生儿呼吸窘迫综合征相关的ABCA3基因突变体c.875A>T(p.E292V)和c.2169G>A(p.M723I)及其绿色荧光表达载体的方法,并观察其在人肺腺癌(A549)细胞株中的表达。方法应用重叠延伸PCR法构建ABCA3基因的两个突变体E292V和M723I,运用限制性酶切连接等技术构建两个突变体的绿色荧光表达载体,使用脂质体Lipofectamine 2000将构建的载体瞬时转染到A549细胞株,使其在体外表达,在荧光显微镜下观察转染效率,利用激光共聚焦显微镜观察重组子的表达情况。结果构建的两个突变体E292V和M723I经测序分别证实ABCA3基因c DNA第875位碱基A变为T和第2169位碱基G变为A,重组子转染A549细胞后,野生型和突变型基因的蛋白质都在细胞内成功表达。结论成功构建了ABCA3基因野生型及突变型的绿色荧光表达载体,并使其在A549细胞表达,为后续实验提供了条件。

关键词： ABCA3 定点突变真核表达人肺腺癌细胞株

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定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达

生物技术通报 2012年第1期28卷 94-98页

作者：袁野蔡渊恒姜世民姜卫红吉林大学畜牧兽医学院长春130062 中科院植物生理生态研究所上海200032

采用定点突变的方法对皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)来源的D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)编码基因的3个位点A18、Y30、K34进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入高表达载体pET-28b中,转化***21(DE3),获得带有... 详细信息

采用定点突变的方法对皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)来源的D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)编码基因的3个位点A18、Y30、K34进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入高表达载体pET-28b中,转化***21(DE3),获得带有组合三突变(A18E/Y30D/K34E)的DCase-SM表达菌株BL21/pET-DCSM。当以IPTG诱导目的蛋白表达时,发现突变菌株(DCase-SM)与出发菌株(DCase)菌株相比,目的蛋白的可溶性表达显著提高,其可溶蛋白比例约为64%;与出发菌株相比,其单位菌体酶活增加427%;另外,与本实验室前期构建的高可溶性三叠加突变体菌株DCase-M3相比,单位菌体酶活亦增加7.9%。

关键词： D-氨甲酰水解酶定点突变诱导表达可溶性酶活

人IL-29的定点突变及抗肿瘤活性初步分析

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生物工程学报 2015年第5期31卷 702-710页

作者：陈伟朱荣葛春蕾陆源李利云李菲邬敏辰江南大学无锡医学院江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122

为探讨人白细胞介素-29(h IL-29)变异体的抗肿瘤活性,根据h IL-29成熟肽的生物信息学分析数据,采用大引物PCR方法对其肽链第33位赖氨酸、35位精氨酸的编码基因进行定点突变,获得的h IL-29变异体基因构建重组真核表达质粒转化毕赤酵母(Pi... 详细信息

为探讨人白细胞介素-29(h IL-29)变异体的抗肿瘤活性,根据h IL-29成熟肽的生物信息学分析数据,采用大引物PCR方法对其肽链第33位赖氨酸、35位精氨酸的编码基因进行定点突变,获得的h IL-29变异体基因构建重组真核表达质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115进行发酵表达,经纯化得到重组人白细胞介素-29变异体蛋白(rh IL-29mut33,35)。经CCK-8法检测抗肿瘤细胞增殖的数据显示,rh IL-29mut33,35对肝癌细胞BEL7402、结肠癌细胞HCT8和胃癌细胞SGC7901的增殖均具有抑制作用,高剂量组对这3种肿瘤细胞的增殖抑制率分别为(30.99±1.58)%、(22.47±1.37)%和(32.05±2.02)%,而且抗增殖作用比野生型rh IL-29的更强(P<0.01),表明变异体rh IL-29mut33,35具有潜在的医药开发价值。

关键词：白细胞介素-29 定点突变变异体抗肿瘤活性

部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变

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生物工程学报 2020年第6期36卷 1232-1240页

作者：肖娟马梦琪梁明星贺如阳陈华波湖北文理学院医学院湖北襄阳441053

重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若... 详细信息

重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。

关键词：基因克隆定点突变重叠延伸PCR 视网膜母细胞瘤基因

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定点突变FGF21提高表达量研究

东北农业大学学报 2013年第3期44卷 83-88页

作者：李德山曹荣邱高华山任桂萍刘明瑶东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

FGF21是一类具有重要糖脂代谢调节功能因子,是治疗2型糖尿病候选药物。但其在大肠杆菌中表达量低且主要以包涵体形式表达,为此根据FGF21与FGF家族同源序列差异,对FGF21进行定点突变以提高其表达量。以pSUMO-FGF21表达载体为模板,在突变... 详细信息

FGF21是一类具有重要糖脂代谢调节功能因子,是治疗2型糖尿病候选药物。但其在大肠杆菌中表达量低且主要以包涵体形式表达,为此根据FGF21与FGF家族同源序列差异,对FGF21进行定点突变以提高其表达量。以pSUMO-FGF21表达载体为模板,在突变位点两端设计引物,采用定点突变方法,将FGF21141位甘氨酸(G)突变为苯丙氨酸(F),构建突变FGF21表达载体pSUMO-mutFGF21;在大肠杆菌中进行表达,纯化mutFGF21蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定分析突变蛋白,HepG2细胞糖吸收试验检测突变蛋白活性。结果成功对pSUMO-hFGF21进行突变,突变蛋白在大肠杆菌中成功表达,经SDS-PAGE分析,主要以可溶形式表达;与野生型FGF21(hFGF21)相比,表达量提高50%。Western blot表明mutFGF21可与FGF21抗体特异性反应。糖吸收试验显示mutFGF21具有与hFGF21一样生物活性并存在剂量依赖性,相比hFGF21,mutFGF21活性略有提高,说明定点突变FGF21(141位G突变为F)可显著提高FGF21表达量。

关键词： FGF21 定点突变表达量促进葡萄糖吸收活性

定点突变对拟穴青蟹肌质钙结合蛋白结构及致敏性的影响

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定点突变对拟穴青蟹肌质钙结合蛋白结构及致敏性的影响

作者：陈一瑜集美大学

学位级别：硕士

甲壳纲水产品是常见的“八大类过敏食物”之一,由其引发的食物过敏现象越来越普遍。肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)是甲壳纲水产品的一种新型过敏原,本文对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中SCP的抗原表位和... 详细信息

甲壳纲水产品是常见的“八大类过敏食物”之一,由其引发的食物过敏现象越来越普遍。肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)是甲壳纲水产品的一种新型过敏原,本文对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中SCP的抗原表位和钙离子结合区域进行深入研究,利用合成肽技术结合血清学实验对其线性表位进行验证;利用定点突变技术对SCP构象表位和钙离子结合区域的关键氨基酸进行突变,分析突变衍生物的致敏性、理化性质、二级结构、表面疏水性及钙离子结合能力,进而获得低致敏性SCP衍生物。本研究利用5种生物信息学软件预测获得6条SCP的线性表位肽段并进行合成,利用血清学实验对其进行验证,发现肽段AA、AA、AA是SCP重要的线性表位;加入化学变性剂后,SCP的Ig E结合活性大部分丧失,表明SCP的空间构象是其具有Ig E结合活性的重要保证。本研究针对构象表位进行突变获得6种衍生物(T38A、E41A、S48A、N53A、C90A、P100A),对钙离子结合区域I或/和钙离子结合区域II进行突变,依次获得3种衍生物D18A/D20A、D70A、D18A/D20A/D70A。与SCP相比,构象表位突变衍生物中S48A(p突变相比,钙离子结合区域的突变对SCP致敏性的影响更显著。为了分析D70A和D18A/D20A/D70A的致敏性与钙离子结合能力的关系,进一步对SCP的三级结构进行模拟分析,结果表明钙离子结合区域II能结合Ca,Asp的突变使钙离子结合区域I表面以正电荷为主,且突变破坏其与Asn和Gly的氢键,而Asp的突变使钙离子结合区域II表面负电荷减少,同时导致其与Asp和Gly的氢键发生断裂。圆二光谱与N-苯基-1-萘胺-8-磺酸荧光探针分析表明,加入钙螯合剂后,D70A和D18A/D20A/D70A的二级结构与表面疏水性均没有显著变化,进一步证明了D70A和D18A/D20A/D70A结合钙离子能力的丧失。综上,本研究发现SCP的3条线性表位AA、AA、AA,且空间构象变化影响SCP免疫结合活性;通过定点突变分析其构象表位及钙离子结合区域,发现钙离子结合位点的突变比构象表位关键氨基酸的突变更显著降低SCP的致敏性;基于此获得的低致敏性SCP衍生物,后续可用于过敏原特异性免疫治疗的替代分子。

关键词：拟穴青蟹肌质钙结合蛋白抗原表位钙离子结合位点定点突变低致敏性

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

同方学位论文库评论

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生物工程学报 2003年第4期19卷 439-443页

作者：余兴龙涂长春徐兴然张茂林陈义祥刘伯华解放军军需大学军事兽医研究所长春130062

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平... 详细信息

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

关键词：猪瘟病毒 E2基因定点突变大肠杆菌表达产物免疫原性

新生儿惊厥相关基因KCNQ2定点突变及其蛋白表达的研究

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中国当代儿科杂志 2011年第8期13卷 611-616页

作者：周熙惠惠智艳史瑞明宋红霞张葳刘俐西安交通大学医学院第一附属医院新生儿科/环境与疾病相关基因教育部重点实验室离子通道研究病室陕西西安710061

目的在收集的1个良性家族性婴儿惊厥家系中发现KCNQ2基因c.812G>T(p.G271V)突变,探讨c.812G>T突变体及其真核表达载体的构建方法,并观察其在人胚肾(HEK)293细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR和限制性内切酶法构建KCNQ2基因c.812G>T突... 详细信息

目的在收集的1个良性家族性婴儿惊厥家系中发现KCNQ2基因c.812G>T(p.G271V)突变,探讨c.812G>T突变体及其真核表达载体的构建方法,并观察其在人胚肾(HEK)293细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR和限制性内切酶法构建KCNQ2基因c.812G>T突变体真核表达载体pcDNA3.0-c.812G>T-KCNQ2,用脂质体转染法将KCNQ2质粒(野生型pcDNA3.0-KCNQ2或突变型pcDNA3.0-c.812G>T-KCNQ2)与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜下观察HEK293细胞,免疫荧光化学法检测蛋白质表达。结果构建的突变体经DNA直接测序示KCNQ2基因cDNA第812位碱基G变为T,突变体在HEK293细胞中成功表达,野生型和突变型基因的蛋白质都在细胞膜上表达,提示KCNQ2钾通道孔区的突变c.812G>T并不影响蛋白的正常表达。结论成功构建KCNQ2突变基因真核表达载体,并在HEK293细胞中表达KCNQ2蛋白,为突变型KCNQ2基因的功能研究及癫癎的分子发病机制研究奠定基础。

关键词： KCNQ2基因定点突变真核表达载体

定点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的研究

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定点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的研究

作者：张蓓蕾华南理工大学

学位级别：硕士

DNA聚合酶是重要的生物技术工具酶,根据氨基酸序列与三维结构的不同,DNA聚合酶可分为6个不同的家族,分别为A、B、C、D、X以及Y家族,其中Bst DNA聚合酶是A家族的一名成员,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌,全酶由三个独立的结构域组成分别是(I)5... 详细信息

DNA聚合酶是重要的生物技术工具酶,根据氨基酸序列与三维结构的不同,DNA聚合酶可分为6个不同的家族,分别为A、B、C、D、X以及Y家族,其中Bst DNA聚合酶是A家族的一名成员,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌,全酶由三个独立的结构域组成分别是(I)5’-3’外切核酸酶结构域;(II)5’-3’聚合酶结构域;(III)3’-5’外切核酸酶结构域。而Bst DNA聚合酶大片段缺少(I)5’-3’外切核酸酶结构域,在核酸扩增中表现出更好的聚合功能。与其他DNA聚合酶相比,Bst DNA聚合酶有着较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,因此更适用于等温扩增中。但是,目前市场上Bst DNA聚合酶受限于国际性大公司如NEB的专利限制,价格比一般的核酸扩增酶昂贵,因此迫切需要开发一种新的更加有效的Bst DNA聚合酶以满足日益增长的市场需求。本研究从一种新的菌株嗜热脂肪芽孢杆菌GIM1.543中取基因组,获得Bst DNA聚合酶基因,并构建重组质粒pET21a-Bst,转化表达宿主,成功实现了Bst DNA聚合酶的诱导表达。通过Bst DNA聚合酶结构以及对其进行同源建模预测的活性位点进行分析,选择4个活性位点(Gly310,Arg412,Lys416,Asp540)进行点突变,用RF克隆方法构建突变体,对其进行表达与Ni柱亲和层析纯化,获得高纯度蛋白。最后以手足口病原体EV71的VP1基因为模板,通过基于IMSA的颜色判定法,恒温荧光法,离子对反高效液相法对表达的各个蛋白进行酶活检测,发现有G310L,G310A,D540E三个突变体蛋白在等温扩增中表现出优于商业化Bst DNA聚合酶的效果。本课题通过定点突变,有效地高了Bst DNA聚合酶的聚合效率,打破国外专利的限制,为Bst DNA聚合酶的国有化供了一种理论基础与思路,具有一定的科研意义和社会效益。

关键词： Bst DNA聚合酶嗜热脂肪地芽孢杆菌定点突变 IMSA