定点突变对拟穴青蟹肌质钙结合蛋白结构及致敏性的影响

作     者：陈一瑜 

作者单位：集美大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘光明

授予年度：2021年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：拟穴青蟹 肌质钙结合蛋白 抗原表位 钙离子结合位点 定点突变 低致敏性 

摘      要：甲壳纲水产品是常见的“八大类过敏食物之一,由其引发的食物过敏现象越来越普遍。肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)是甲壳纲水产品的一种新型过敏原,本文对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中SCP的抗原表位和钙离子结合区域进行深入研究,利用合成肽技术结合血清学实验对其线性表位进行验证;利用定点突变技术对SCP构象表位和钙离子结合区域的关键氨基酸进行突变,分析突变衍生物的致敏性、理化性质、二级结构、表面疏水性及钙离子结合能力,进而获得低致敏性SCP衍生物。本研究利用5种生物信息学软件预测获得6条SCP的线性表位肽段并进行合成,利用血清学实验对其进行验证,发现肽段AA、AA、AA是SCP重要的线性表位;加入化学变性剂后,SCP的Ig E结合活性大部分丧失,表明SCP的空间构象是其具有Ig E结合活性的重要保证。本研究针对构象表位进行突变获得6种衍生物(T38A、E41A、S48A、N53A、C90A、P100A),对钙离子结合区域I或/和钙离子结合区域II进行突变,依次获得3种衍生物D18A/D20A、D70A、D18A/D20A/D70A。与SCP相比,构象表位突变衍生物中S48A(p0.01)和P100A(p0.05)的免疫结合活性显著降低,D70A和D18A/D20A/D70A的免疫结合活性极显著降低,且D70A和D18A/D20A/D70A显著下调嗜碱性粒细胞表面分子CD63和CD203c的表达水平,此外,D70A和D18A/D20A/D70A对热、酸不稳定,耐胃液消化但不耐肠液消化,α-螺旋含量降低,表面疏水性升高。由此表明,与构象表位的突变相比,钙离子结合区域的突变对SCP致敏性的影响更显著。为了分析D70A和D18A/D20A/D70A的致敏性与钙离子结合能力的关系,进一步对SCP的三级结构进行模拟分析,结果表明钙离子结合区域II能结合Ca,Asp的突变使钙离子结合区域I表面以正电荷为主,且突变破坏其与Asn和Gly的氢键,而Asp的突变使钙离子结合区域II表面负电荷减少,同时导致其与Asp和Gly的氢键发生断裂。圆二光谱与N-苯基-1-萘胺-8-磺酸荧光探针分析表明,加入钙螯合剂后,D70A和D18A/D20A/D70A的二级结构与表面疏水性均没有显著变化,进一步证明了D70A和D18A/D20A/D70A结合钙离子能力的丧失。综上,本研究发现SCP的3条线性表位AA、AA、AA,且空间构象变化影响SCP免疫结合活性;通过定点突变分析其构象表位及钙离子结合区域,发现钙离子结合位点的突变比构象表位关键氨基酸的突变更显著降低SCP的致敏性;基于此获得的低致敏性SCP衍生物,后续可用于过敏原特异性免疫治疗的替代分子。