部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变

作     者：肖娟 马梦琪 梁明星 贺如阳 陈华波 Juan Xiao;Mengqi Ma;Mingxing Liang;Ruyang He;Huabo Chen

作者机构：湖北文理学院医学院湖北襄阳441053 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2020年第36卷第6期

页      面：1232-1240页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划(No.T201715) 湖北文理学院大学生创新创业训练计划项目(No.X201910519062)资助 

主　　题：基因克隆 定点突变 重叠延伸PCR 视网膜母细胞瘤基因 

摘      要：重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。