定点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的研究

作     者：张蓓蕾 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李杉

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：Bst DNA聚合酶 嗜热脂肪地芽孢杆菌 定点突变 IMSA 

摘      要：DNA聚合酶是重要的生物技术工具酶,根据氨基酸序列与三维结构的不同,DNA聚合酶可分为6个不同的家族,分别为A、B、C、D、X以及Y家族,其中Bst DNA聚合酶是A家族的一名成员,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌,全酶由三个独立的结构域组成分别是(I)5’-3’外切核酸酶结构域;(II)5’-3’聚合酶结构域;(III)3’-5’外切核酸酶结构域。而Bst DNA聚合酶大片段缺少(I)5’-3’外切核酸酶结构域,在核酸扩增中表现出更好的聚合功能。与其他DNA聚合酶相比,Bst DNA聚合酶有着较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,因此更适用于等温扩增中。但是,目前市场上Bst DNA聚合酶受限于国际性大公司如NEB的专利限制,价格比一般的核酸扩增酶昂贵,因此迫切需要开发一种新的更加有效的Bst DNA聚合酶以满足日益增长的市场需求。本研究从一种新的菌株嗜热脂肪芽孢杆菌GIM1.543中取基因组,获得Bst DNA聚合酶基因,并构建重组质粒pET21a-Bst,转化表达宿主,成功实现了Bst DNA聚合酶的诱导表达。通过Bst DNA聚合酶结构以及对其进行同源建模预测的活性位点进行分析,选择4个活性位点(Gly310,Arg412,Lys416,Asp540)进行点突变,用RF克隆方法构建突变体,对其进行表达与Ni柱亲和层析纯化,获得高纯度蛋白。最后以手足口病原体EV71的VP1基因为模板,通过基于IMSA的颜色判定法,恒温荧光法,离子对反高效液相法对表达的各个蛋白进行酶活检测,发现有G310L,G310A,D540E三个突变体蛋白在等温扩增中表现出优于商业化Bst DNA聚合酶的效果。本课题通过定点突变,有效地高了Bst DNA聚合酶的聚合效率,打破国外专利的限制,为Bst DNA聚合酶的国有化供了一种理论基础与思路,具有一定的科研意义和社会效益。