检索结果-南通市图书馆

中国畜牧兽医 2022年第11期49卷 4356-4363页

作者：楚品品蒋智勇李春玲勾红潮李艳蔡汝健广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

【目的】研究纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)PRRSV(0.0001~0.1)黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5μg/mL,0.375、0.75、1.5μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间(3、6、12、18、24 h)加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。

关键词：纳米银(AgNPs) 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 抗病毒活性作用机制

猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

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华南农业大学学报 2016年第1期37卷 1-7页

作者：朱俊灵叶佐东邓洁汝勾红潮陈金顶华南农业大学兽医学院广东广州510642

【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classica... 详细信息

【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。

关键词：猪瘟病毒 NS5B基因环介导等温扩增技术横向流动试纸条技术病毒检测

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革兰阴性菌外膜囊泡的研究进展

畜牧与兽医 2020年第5期52卷 136-142页

作者：卞志标李冰勾红潮杨君臧莹安李春玲仲恺农业工程学院广东广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 茂名市动物疫病预防控制中心广东茂名525000

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是革兰阴性(G^-)菌从细胞膜上脱落下来的囊泡,携带有细菌的大量组分,如外膜蛋白、脂多糖、脱氧核糖核酸等。由于OMVs无活性、不能复制且具有免疫原性,所以被认为是最具潜力的亚单位疫苗,同时OMV... 详细信息

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是革兰阴性(G^-)菌从细胞膜上脱落下来的囊泡,携带有细菌的大量组分,如外膜蛋白、脂多糖、脱氧核糖核酸等。由于OMVs无活性、不能复制且具有免疫原性,所以被认为是最具潜力的亚单位疫苗,同时OMVs对细菌本身具有多种作用,故OMVs成为研究的热点。本文从G^-菌OMVs的组成成分、形成机制、生物学功能、提取纯化方法及其开发应用前景5个方面综述其研究现状,为G^-菌的致病机制研究、OMVs的疫苗开发应用提供技术指导。

关键词： OMVs 形成机制组分分析生物学功能

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

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中国畜牧兽医 2022年第5期49卷 1934-1941页

作者：谢思豪勾红潮卞志标李斌蔡汝健臧莹安李春玲仲恺农业工程学院广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640 广州市从化区动物卫生监督所广州510900

【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

关键词： MLKL基因 CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除 PK-15细胞猪伪狂犬病病毒(PRV)

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法建立与应用

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中国动物传染病学报 2021年

作者：张昆丽席振军徐民生李艳勾红潮楚品品蔡汝健李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌（APP）检测方法，本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4（APxⅣ）序列合成特异性引物，通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示，该纳米PCR对APP的检测... 详细信息

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌（APP）检测方法，本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4（APxⅣ）序列合成特异性引物，通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示，该纳米PCR对APP的检测下限为1 × 10;CFU/mL，其灵敏度是普通PCR的10倍。且特异性结果显示，该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带，而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性。最后应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料，结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07％（7/41）和19.51％（8/41），以上结果表明，本研究成功建立的APP的纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好，可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR 检测方法

基于CHO-K1细胞稳定表达的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 135-142页

作者：蒋智勇蔡汝健李艳郭怡德楚品品宋帅勾红潮李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩... 详细信息

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过Western-blot验证其反应原性。结果表明,ASFV CD2v蛋白在CHO-K1细胞中被成功表达,并能与ASFV抗体阳性血清反应。以纯化的GFP-CD2v重组蛋白为包被抗原建立检测ASFV CD2v蛋白抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原最佳包被质量浓度为1.25μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳稀释度为1∶50000,以此建立的ASFVCD2v蛋白的间接ELISA方法临界值为0.31;该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒等病毒抗体阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性较强;用该ELISA方法检测阳性血清敏感性可达1∶1600;批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本试验中建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV抗体的检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 CD2v CHO-K1细胞稳定表达间接ELISA

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用

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中国动物传染病学报 2023年第2期31卷 114-119页

作者：张昆丽席振军徐民生李艳勾红潮楚品品蔡汝健李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×... 详细信息

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR 检测方法

副猪嗜血杆菌lpxL基因介导的生物被膜形成及黏附入侵能力的分析

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中国兽医科学 2020年第12期50卷 1542-1548页

作者：席振军秦翠丽宋帅张昆丽勾红潮李春玲河南科技大学河南洛阳471000 广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640

为了研究lpxL基因在副猪嗜血杆菌生物被膜形成及对细胞黏附入侵方面的作用,采用同源重组方法构建副猪嗜血杆菌lpxL基因缺失株H45-ΔlpxL;与野生株H45进行生物学特性比较。结果表明,lpx L基因缺失后,副猪嗜血杆菌的生长速度小于野生株;... 详细信息

为了研究lpxL基因在副猪嗜血杆菌生物被膜形成及对细胞黏附入侵方面的作用,采用同源重组方法构建副猪嗜血杆菌lpxL基因缺失株H45-ΔlpxL;与野生株H45进行生物学特性比较。结果表明,lpx L基因缺失后,副猪嗜血杆菌的生长速度小于野生株;生物被膜合成量减小,对猪肾上皮细胞(PK-15)的黏附能力与入侵能力均有一定程度的减弱。结论,lpxL基因对副猪嗜血杆菌的增殖以及致病性都会产生一定作用。

关键词：副猪嗜血杆菌 lpxL 脂多糖黏附入侵

纳米银对猪链球菌体外抗菌活性及其生物膜形成的影响

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中国畜牧兽医 2022年第3期49卷 1172-1180页

作者：刘宝玲李春玲蒋智勇杨冬霞张昆丽楚品品勾红潮蔡汝健广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640 仲恺农业工程学院动物科技学院广州510225

【目的】研究纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)对多重耐药猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)的体外抗菌活性及其生物膜形成的影响,为解决猪链球菌的耐药问题提供参考。【方法】以5株临床分离的多重耐药猪链球菌(S1018、S894、S786... 详细信息

【目的】研究纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)对多重耐药猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)的体外抗菌活性及其生物膜形成的影响,为解决猪链球菌的耐药问题提供参考。【方法】以5株临床分离的多重耐药猪链球菌(S1018、S894、S786、S815和S844)为研究对象,采用微量肉汤稀释法测定AgNPs对5株猪链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),通过测定AgNPs作用下细菌的生长速率以及不同浓度AgNPs对猪链球菌的抑制率来评价AgNPs的抗菌活性;通过结晶紫染色法测定各菌株生物膜的形成能力和6.25、12.5、25、50μg/mL AgNPs对5株多重耐药猪链球菌菌株生物膜形成的影响。【结果】AgNPs对S1018株的MIC和MBC均为12.5μg/mL,对其余4株多重耐药猪链球菌的MIC和MBC均为25.0μg/mL;AgNPs对多重耐药猪链球菌的抗菌活性好,25~100μg/mL AgNPs对5株菌的抑制率可以达到96.60%~99.70%,在1/2MIC、1MIC和2MIC AgNPs作用下细菌生长速率明显受到抑制。5株多重耐药猪链球菌均能形成生物膜,6.25、12.5、25、50μg/mL AgNPs对5株多重耐药猪链球菌菌株生物膜形成的抑制率为17.98%~45.58%。【结论】AgNPs对多重耐药猪链球菌的活性和生物膜形成均具有抑制作用。

关键词：纳米银多重耐药猪链球菌生物膜