基于CHO-K1细胞稳定表达的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

作     者：蒋智勇 蔡汝健 李艳 郭怡德 楚品品 宋帅 勾红潮 李春玲 JIANG Zhi-yong;CAI Ru-jian;LI Yan;GUO Yi-de;CHU Pin-pin;SONG Shuai;GOU Hong-chao;LI Chun-ling

作者机构：广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 

出 版 物：《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)

年 卷 期：2022年第52卷第2期

页      面：135-142页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：广东省重点领域研发计划项目(2019B020211005) 广东省现代农业产业技术体系创新团队项目(2019KJ119) 广东省农业科学院院长基金项目(202044)。 

主　　题：非洲猪瘟病毒 CD2v CHO-K1细胞 稳定表达 间接ELISA 

摘      要：为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过Western-blot验证其反应原性。结果表明,ASFV CD2v蛋白在CHO-K1细胞中被成功表达,并能与ASFV抗体阳性血清反应。以纯化的GFP-CD2v重组蛋白为包被抗原建立检测ASFV CD2v蛋白抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原最佳包被质量浓度为1.25μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳稀释度为1∶50000,以此建立的ASFVCD2v蛋白的间接ELISA方法临界值为0.31;该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒等病毒抗体阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性较强;用该ELISA方法检测阳性血清敏感性可达1∶1600;批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本试验中建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV抗体的检测。