MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

作     者：谢思豪 勾红潮 卞志标 李斌 蔡汝健 臧莹安 李春玲 XIE Sihao;GOU Hongchao;BIAN Zhibiao;LI Bin;CAI Rujian;ZANG Yingan;LI Chunling

作者机构：仲恺农业工程学院广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640 广州市从化区动物卫生监督所广州510900 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2022年第49卷第5期

页      面：1934-1941页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家“十三五”重点研发专项课题(2018YFD0500804、2016YFD0500709) 国家自然科学基金青年科学基金项目(31902273) 广东省自然科学基金项目(2019A1515010757、2017A030310074) 广州市科技计划项目一般项目(201804010071) 科技创新战略专项(高水平农科院建设)(R2017YJ-YB2005、R2018QD-094)。 

主　　题：MLKL基因 CRISPR/Cas9基因编辑技术 敲除 PK-15细胞 猪伪狂犬病病毒(PRV) 

摘      要：【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P0.01;P0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。