未折叠蛋白通路因子ATF4调控三阴性乳腺癌的耐药研究

作     者：韩雅琦 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张金库

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：三阴性乳腺癌 ATF4 UPR 耐药 化疗 

摘      要：三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是一种恶性度高且预后较差的原发性乳腺癌亚型,约占全部乳腺癌的10-15%。由于其雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2均阴性的特殊分子表型,TNBC缺乏内分泌或分子靶向治疗的机会,这对于患者的生存质量和预后产生较严重的影响。 内质网在真核细胞中能够合成、修饰和运输膜结合蛋白质或分泌蛋白质和脂质。错误折叠的蛋白质在内质网堆积会破坏内质网的稳定状态,致使内质网应激(Endoplasmic reticulum Stress,ERS)。此时,暴露于ERS下的细胞会触发一种细胞适应的自我保护机制——未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。近年来,经证实UPR参与乳腺癌的生物学功能的调控,并被指出其中关键通路蛋白激酶RNA样ER激酶(Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)与肿瘤耐药相关。ATF4(Activating transcription factor 4,ATF4)作为PERK通路重要下游因子,在控制肿瘤进展和耐药反应方面扮演着重要角色,在许多药物抵抗性强的肿瘤中表达上调,这提示ATF4可能成为解决TNBC耐药问题有效突破口之一。 目的: 本研究通过对收集TNBC临床资料、药物敏感性的体外实验以及药物敏感性的体内实验三部分进行有关ATF4对化疗药物敏感性和影响的研究,进一步探讨非折叠蛋白通路因子ATF4与TNBC耐药的机制,为解决TNBC化疗耐药提供了新的理论基础。 方法: 1.收集保定市第一中心医院病理科在2016年1月-2023年5月间诊断为TNBC的组织样本及临床资料,符合纳入标准的共38例,患者均为女性。应用免疫组织化学染色检测ATF4在TNBC的组织中的表达水平。通过结合收集到的临床病理特征,初步探索ATF4与TNBC耐药在临床上的关系。 2.药物敏感性实验:以乳腺癌细胞系***.231和MCF7细胞为模型,对ATF4进行敲降或过表达;通过Western blot和PCR法检测ATF4在乳腺癌细胞株中的敲降或过表达效果;把构建好的ATF4敲降或过表达的乳腺癌细胞进行体外的细胞药物处理和存活增殖实验,通过CCK8法和流式细胞检测法检测ATF4对肿瘤细胞药物敏感性的影响;最终,通过裸鼠皮下成瘤实验,在动物层面验证ATF4对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响。 结果: 1.回顾性分析38例TNBC女性患者的临床病理特征,并对其相应组织蜡块进行ATF4免疫组织化学染色。统计分析结果显示,TNBC中ATF4表达水平与是否化疗耐药差异有统计学意义。 2.通过Western blot检测,我们观察到与对照组(sh Scram)相比,实验敲降组(sh ATF4-1和sh ATF4-2)中的ATF4表达水平下调,证明细胞敲降效果显著;同样地,与对照组(Ctrl)相比,过表达组(ATF4-OE)中的ATF4表达水平上调,证明细胞过表达效果明显。 3.在药物敏感性的体外实验中,我们通过调整药物浓度观察肿瘤细胞的存活率,并在固定药物浓度下比较肿瘤细胞的凋亡情况。结果显示,ATF4基因敲降可以显著提高TNBC细胞对化疗药物的敏感性;ATF4基因过表达可以显著增加管腔型乳腺癌对化疗药物的抗性。 4.药物敏感性体内实验中,我们通过裸鼠皮下成瘤实验发现,实验组(sh ATF4-1)与对照组(sh Scram)相比,在给药的情况下,肿瘤的体积和重量都出现了明显的下降,这进一步验证了敲降ATF4能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤生长。 结论: ATF4是一个新的调节TNBC耐药关键因子。在TNBC中,ATF4表达水平与是否耐药相关。ATF4表达水平降低时,可显著提高TNBC细胞对化疗药物的敏感性。此外,ATF4可能是一个具有广谱功能的耐药调节因子。