多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

作     者：贾伟 杭赛宇 史宁 周迎会 吴士良 JIA Wei;HANG Sai-yu;SHI Ning;ZHOU Ying-hui;WU Shi-liang

作者机构：苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123 

出 版 物：《江苏大学学报（医学版）》 (Journal of Jiangsu University：Medicine Edition)

年 卷 期：2006年第16卷第2期

页      面：93-96页

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

基　　金：国防基础科研计划资助项目(K0102061501-03) 江苏省高校自然科学研究基金资助项目(01KJB310001) 

主　　题：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 原核表达 GST融合蛋白 谷胱甘肽-琼脂糖米和层析 酶活检测 

摘      要：目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(***)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(G lutath ione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经W estern印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。