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CYP450维生素D羟化酶基因的克隆表达及酶活检测

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CYP450维生素D羟化酶基因的克隆表达及酶活检测

作者：曹喜秀广西大学

学位级别：硕士

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一类以非共价结合的血红素-亚铁离子为活性中心的蛋白酶超家族,与CO结合后在450 nm处有最大吸收峰,主要进行内源性和外源性化合物代谢,可催化多种氧化反应和还原反应。维生素D作为一种人体必需... 详细信息

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一类以非共价结合的血红素-亚铁离子为活性中心的蛋白酶超家族,与CO结合后在450 nm处有最大吸收峰,主要进行内源性和外源性化合物代谢,可催化多种氧化反应和还原反应。维生素D作为一种人体必需的脂溶性激素原,在钙磷代谢、免疫调节和细胞增殖和分化等方面发挥重要作用,然而其本身并无活性,需羟基化后才能具备生理功能。维生素D羟化酶是一类独特CYP450酶类,能催化维生素D特定位点羟基化反应,产生活性衍生物。1α,25(OH)2维生素D即为维生素D衍生物的一种,参与众多调控及代谢过程,具有重要医学和研究价值。尽管可以用化学法来合成,然而该法生产步骤多,效率低下、伴随产物多,不利于扩大化生产。利用微生物专一性维生素D羟化酶合成该化合物,对经济效益与环境保护具有双赢意义。本研究克隆和表达了自行筛选菌株的羟基化酶基因CYPvdh。研究中确立了该菌总DNA的优化提取方案,通过PCR技术获得了该酶的DNA片段,GC含量高达73%,成功构建pMD18-T克隆质粒,利用亚克隆技术获得目的片段的ORF,并插入表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒。将重组质粒转化到***21(DE3)中,在25℃、0.8mmol/LIPTG条件下诱导4h,超声波破胞后获得重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该蛋白具有可溶性,在44KD处出现强特异性条带。利用试剂盒法得到纯化重组蛋白。质谱分析证实表达蛋白为维生素D羟化酶,且属于CYP450家族。生物信息学软件分析显示,维生素D羟化酶等电点为4.73,分子量为44.4 KD;其136-367 aa为保守的P450 Domain,无跨膜结构域,为可溶性胞内蛋白,实验结果与其吻合。进化比对结果表明CYPvdh与其它菌属的亲缘关系,进一步体现其具有P450酶系在进化过程中的高度保守性,也显示其功能性的差异和独特性。NADPH体外检测法显示异源表达的维生素D羟化酶具有生物催化活性。NADPH法进行酶学性质研究,结果表明不同pH值、温度及[K+]、[Na+]浓度都对CYPvdh酶相对酶活产生影响,通过单因素实验确定,CYPvdh在pH7.5、温度为30℃、[K+]、[Na+]皆为10mmol/L的情况下的催化效率最高。

关键词：细胞色素维生素D羟化酶亚克隆蛋白表达酶活检测

小鼠吸入香烟烟雾染毒过程的标准化和使用酶活检测在烟熏小鼠中基因CYP1A1的表达(英文)

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辽宁大学学报（自然科学版） 2003年第1期30卷 1-6页

作者：周仁清沈英娃周樱桥薄涛沙莉阿尔夫瑞德.豪葛辽宁大学生命科学系辽宁沈阳110036 国家环境保护化学品登记中心北京100012 中国科学院沈阳生态研究所辽宁沈阳110015 美国密执安州立大学微生物系西兰辛48824

建立了一个通过测定茄尼醇的含量来确定小鼠吸入香烟烟雾浓度的方法 ,因而使得来自不同实验室的相关数据的比成为可能 .同时 ,对香烟烟雾诱导雄性小鼠NMR1的肺微粒体中细胞色素P4 5 0异构基因CYP1A1的表达在蛋白质的水平上进行了测试 .... 详细信息

建立了一个通过测定茄尼醇的含量来确定小鼠吸入香烟烟雾浓度的方法 ,因而使得来自不同实验室的相关数据的比成为可能 .同时 ,对香烟烟雾诱导雄性小鼠NMR1的肺微粒体中细胞色素P4 5 0异构基因CYP1A1的表达在蛋白质的水平上进行了测试 .测试结果表明 ,代表CYP1A1蛋白活性的 7 乙氧基试卤灵 O 去乙基酶的活性在小鼠的肺中随着吸入香烟烟雾的增加而上升 ;由此可知 ,香烟烟雾诱导了小鼠肺中基因CYP1A1的表达 .

关键词：香烟烟雾染毒过程标准化酶活检测茄尼醇 CYP1A1基因小鼠肺基因表达烟雾浓度

碳酸酐酶的应用研究现状及其酶活检测方法述评

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发酵科技通讯 2014年第4期43卷 52-56页

作者：马晓舟张朝晖浙江工业大学生物与环境工程学院浙江杭州310014

碳酸酐酶(CA)是一类催化二氧化碳和水生成碳酸氢根和氢离子的可逆反应的锌酶。它广泛存在于动植物及微生物体中,且在生物加工过程中起重要作用。由于碳酸酐酶的特性,它正被广泛应用于诸如生物检测、天然活性物质的筛选、生物传感器、CO... 详细信息

碳酸酐酶(CA)是一类催化二氧化碳和水生成碳酸氢根和氢离子的可逆反应的锌酶。它广泛存在于动植物及微生物体中,且在生物加工过程中起重要作用。由于碳酸酐酶的特性,它正被广泛应用于诸如生物检测、天然活性物质的筛选、生物传感器、CO2捕集和生理诊断等领域。对碳酸酐酶的应用现状以及碳酸酐酶的酶活测定方法进行了综述。

关键词：碳酸酐酶应用现状酶活检测

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不同底物对植酸酶酶活检测的影响

饲料工业 2007年第20期28卷 17-18页

作者：赵剑李光智郭宝林马玲北京昕大洋科技发展有限公司

试验采用2×5完全随机试验设计,考察不同底物(P3168和P8810)对不同酶活水平(6000、8000、10000、12000和16000U/g)的植酸酶酶活检测的影响。结果表明,以P8810为底物检测的植酸酶酶活显著高于使用P3168为底物的检测结果,但底物类型与酶... 详细信息

试验采用2×5完全随机试验设计,考察不同底物(P3168和P8810)对不同酶活水平(6000、8000、10000、12000和16000U/g)的植酸酶酶活检测的影响。结果表明,以P8810为底物检测的植酸酶酶活显著高于使用P3168为底物的检测结果,但底物类型与酶活水平之间没有显著的互作效应。使用P8810与使用P3168的检测结果之间存在显著的线性关系(P=0.00),线性方程为:y(P3168)=0.843x(P8810)-431.16,R2=0.987。通过对曲线预测值验证的结果表明,可以使用P8810替代P3168作为底物进行植酸酶酶活检测。

关键词：植酸酶酶活检测底物

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

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江苏大学学报（医学版） 2006年第2期16卷 93-96页

作者：贾伟杭赛宇史宁周迎会吴士良苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123

目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(***)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全... 详细信息

目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(***)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(G lutath ione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经W estern印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。

关键词：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 原核表达 GST融合蛋白谷胱甘肽-琼脂糖米和层析酶活检测

多星韭花朵呈色基因AwDFRs和AwFLS1的功能研究

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多星韭花朵呈色基因AwDFRs和AwFLS1的功能研究

作者：张艳贵州师范大学

学位级别：硕士

多星韭(Allium wallichii),是石蒜科葱属的一种多年生草本植物,多数拥有疏散或密集的花序,入药具有活血散瘀、祛风止痒、治疗创伤疹癣的功能,此外,多星韭花型独特、花色丰富,可作为良好的实验研究材料。花色苷是类黄酮途径的终产物,在... 详细信息

多星韭(Allium wallichii),是石蒜科葱属的一种多年生草本植物,多数拥有疏散或密集的花序,入药具有活血散瘀、祛风止痒、治疗创伤疹癣的功能,此外,多星韭花型独特、花色丰富,可作为良好的实验研究材料。花色苷是类黄酮途径的终产物,在植物花色呈色中起着决定性作用,类黄酮代谢途径中的二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)和黄酮醇合酶(Flavonol synthase,FLS),均可利用二氢黄酮醇将催化产物分别流向花色素分支和黄酮醇分支。目前,对多星韭DFR和FLS的研究尚未见报道,因此,本文从多星韭中克隆得到两条DFR基因和一条FLS基因,分别命名为AwDFR1、AwDFR2和AwFLS1,并对上述基因的催化活性和生物学功能进行解析,主要研究结果如下:1.成功从多星韭花朵中扩增出AwDFR1、AwDFR2、AwFLS1全长序列,开放阅读框长度分别为1155 bp、1149 bp、1008 bp,分别编码384、382、335个氨基酸。2.通过生物信息学在线网站对AwDFR1、AwDFR2和AwFLS1进行预测,发现AwDFR1、AwDFR2和AwFLS1的分子量大小分别为42.79 KDa、42.71 KDa、38.22 Kda;AwDFRs蛋白是酸性稳定亲水性蛋白,AwFLS1蛋白则是一种酸性不稳定亲水性蛋白,三者均无跨膜域、信号肽,同源建模与二级预测结果一致,主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要定位于细胞质。多序列分析结果表明,AwDFRs蛋白具有高度保守的NADP(H)结合位点,含有底物结合区;AwFLS1蛋白则含有高度保守的2-ODD特异性基序,包含亚铁结合区(H×D×n H)和二氧葡萄糖酸盐结合区(R×S)。系统进化树分析发现,AwDFRs与洋葱Ac DFR亲缘关系最近,AwFLS1则与越橘Vc FLS、拟南芥At FLS1亲缘关系最近。***与AwFLS1的表达量分析结果显示,AwDFRs的表达量伴随花朵的绽放,呈现出先降低后升高的变化趋势,直至盛开期达到最大;而AwFLS1基因表达量在花朵开放过程中,则呈现出逐渐降低的变化趋势,在盛开期降为最低。AwDFR1、AwDFR2在叶、花轴和花瓣中的表达量较高,根中最低;AwFLS1在叶中的表达量最高,根中最低,AwDFRs基因和AwFLS1基因均表现出显著的时间和空间特异性。4.分别构建pET32a-AwDFRs、pET32a-AwFLS1原核表达载体,经过表达验证、诱导条件摸索、纯化、透析等步骤制备重组蛋白,分别以二氢黄酮醇(DHK,DHQ,DHM)为底物检测AwDFRs、AwFLS1的催化性质。结果显示,在DHQ和DHM与AwDFRs的反应中观察到明显的颜色变化,用HPLC检测到花色素产物的存在,而在DHK的反应中未检测到相应的产物;而在AwFLS1催化三种底物的反应中均检测到黄酮醇的存在,说明AwFLS1可催化上述三种二氢黄酮醇底物反应生成相应的黄酮醇。5.分别构建pBI121-AwDFRs、pBI121-AwFLS1真核表达载体,经浸花法将AwDFRs重组菌转入拟南芥tt3-1突变体中,AwFLS1转入野生型(Wild Type,WT)拟南芥中。结果显示,AwDFRs回补了拟南芥tt3-1突变体的种皮、幼苗子叶和下胚轴颜色,同时,HPLC检测到AwDFRs转基因植株幼苗中花色苷积累显著增加。过表达AwFLS1的拟南芥幼苗叶柄基部由紫色变为绿色,花色苷积累减少,黄酮醇含量显著增加。综上所述,AwDFRs具备催化DHQ和DHM的功能,而无DHK的催化活性;AwFLS1则可催化三种二氢黄酮醇底物。过表达AwDFRs可显著增加拟南芥tt3-1突变体的花青素积累量,从而加深转基因植株种皮、幼苗子叶和下胚轴的颜色;而过表达AwFLS1则显著增加WT拟南芥中的黄酮醇含量,导致WT拟南芥幼苗子叶和下胚轴的颜色变浅。

关键词：多星韭二氢黄酮醇4-还原酶黄酮醇合酶酶活检测遗传转化

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

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中国农业科学 2017年第6期50卷 1057-1066页

作者：赵盼张学尧刘晓健赵小明于荣荣董玮马恩波张建珍张敏山西大学应用生物学研究所山西大学生命科学学院

【目的】体外真核表达飞蝗（Locusta migratoria）几丁质脱乙酰基酶1和2（chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2）并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据... 详细信息

【目的】体外真核表达飞蝗（Locusta migratoria）几丁质脱乙酰基酶1和2（chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2）并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子（Q-Sepharose）交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽（signal peptide）、几丁质结合域（chitin binding peritrophin-A,Ch BD）、A型低密度脂蛋白受体结构域（low-density lipoprotein receptor class A,LDLa）和脱乙酰基酶催化结构域（catalytic domain,CDA）。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间（67—84 aa）的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸（84—106 aa）之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL;,并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。

关键词：飞蝗几丁质脱乙酰基酶真核表达蛋白纯化酶活检测

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

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生物工程学报 2011年第9期27卷 1363-1370页

作者：夏芳李厚华付春祥虞珍珍徐彦军赵德修中国科学院植物研究所北京100093 中国科学院研究生院北京100049 中国农业大学理学院北京100193

从水母雪莲Saussurea medusa ***文库中得到一段查尔酮合酶基因(SmCHS)片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构... 详细信息

从水母雪莲Saussurea medusa ***文库中得到一段查尔酮合酶基因(SmCHS)片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。

关键词：水母雪莲查尔酮合酶原核表达纯化酶活检测

基于大环分子葫芦脲的鸟氨酸脱羧酶实时无标记活性分析方法的改进与应用

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生物工程学报 2021年第8期37卷 2903-2914页

作者：王静刘翔琛马红艳陈强刘森湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室/细胞调控与分子药物“111”引智基地湖北武汉430068 三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途径中的关键酶,其主要功能是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。在多种疾病和肿瘤细胞中,ODC的表达水平和催化活性都高于正常细胞,因此抑制ODC的活性是相关疾病预防和治疗的一个潜在途... 详细信息

鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途径中的关键酶,其主要功能是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。在多种疾病和肿瘤细胞中,ODC的表达水平和催化活性都高于正常细胞,因此抑制ODC的活性是相关疾病预防和治疗的一个潜在途径。ODC抑制剂的发现和检验依赖于对其催化反应进程的监测,常采用的途径包括利用高效液相色谱法检测腐胺产量和利用同位素标记法检测二氧化碳的产量等。这些检测方法的繁琐操作和成本极大地限制了其应用,尤为突出的问题是这些方法很难实现高通量检测和实时检测。文中研究了基于大环分子葫芦[6]脲(Cucurbit[6]uril,CB6)与荧光染料DSMI(Trans-4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-methylpyridinium iodide)的ODC酶活实时无标记检测法,系统分析了其应用范围和局限性,并对其进行了优化。最后,利用优化后的方法实现了对不同机制ODC抑制剂的活性评价。

关键词：鸟氨酸脱羧酶抑制剂实时无标记酶活检测