土荆皮乙酸的抗多房棘球蚴作用及其机制研究

作     者：陈青 达哇卓玛 刘川川 樊海宁 CHEN Qing;DAWA Zhuoma;LIU Chuanchuan;FAN Haining

作者机构：青海大学临床医学院西宁810001 青海大学附属医院肝胆胰外科西宁810001 青海省包虫病研究重点实验室西宁810001 

出 版 物：《中国普外基础与临床杂志》 (Chinese Journal of Bases and Clinics In General Surgery)

年 卷 期：2024年第31卷第6期

页      面：695-705页

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

基　　金：青海省科技厅项目(项目编号:2023-ZJ-992Q) 

主　　题：多房棘球绦虫 土荆皮乙酸 原头节 囊泡 生发层细胞 细胞凋亡 血管生成 磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 

摘      要：目的探讨土荆皮乙酸(pseudolaric acid B,PAB)体外对原头节细胞凋亡的影响,以及体内对病灶-宿主微环境组织中血管生成和细胞凋亡的调节作用及其可能机制,为临床开发多房棘球蚴病新型替代药物提供依据。方法体外实验:原头节、囊泡、生发层细胞、人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFFs)和正常人肝细胞经不同浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、160和320μmol/L)的PAB分别处理7、5、5、5、5 d后,评价原头节存活率、囊泡磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI)释放水平、生发层细胞活力及HFFs和正常人肝细胞活力;原头节和囊泡经2.5%戊二醛固定后用于扫描电镜和透射电镜观察。动物实验:从保种沙鼠腹腔病灶中分离原头节,然后腹腔注射感染18只C57BL/6J小鼠建立模型,随机分为3组,每组6只:模型组(Model组)每日给予0.3 mL PBS缓冲液灌胃;阿苯达唑(albendazole,ABZ)组每日给予0.3 mL ABZ(100 mg/kg)灌胃;PAB组每日予以0.3 mL PAB(40 mg/kg)灌胃。连续灌胃6周后,取病灶-宿主微环境组织,采用ELISA法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3,caspase3)的表达水平,采用生化检测试剂盒检测一氧化氮(nitric oxide,NO)的表达水平,采用Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(BCL2-associated X protein、Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、caspase3、活化caspase3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase3,cleaved-caspase3)、VEGF、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、磷脂肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及磷酸化AKT(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)蛋白的表达水平。结果体外实验:体外不同浓度PAB与多房棘球绦虫原头节共培养7 d后,40、80、160和320μmol/L组原头节分别在6、4、2和1 d后全部死亡;PAB对多房棘球绦虫原头节表现出一定的时间和浓度依赖性。多房棘球绦虫囊泡及生发层细胞经PAB处理后,随着PAB浓度增大,培养上清液中PGI释放量逐渐增加[半数最大效应浓度值为(24.40±1.42)μmol/L],生发层细胞活力明显被抑制[半数抑制浓度值为(15.94±2.55)μmol/L]。PAB对哺乳动物细胞无明显毒性。20μmol/L PAB干预原头节3 d后Bax和caspase3蛋白的表达水平上调,Bcl2蛋白表达水平下调。动物实验:与Model组相比,PAB组和ABZ组小鼠的病灶湿重均降低(P0.01),PAB组和ABZ组的病灶生长抑制率分别为91.03%和74.44%;ABZ组和PAB组小鼠病灶-宿主微环境组织中增殖及血管生成指标(Ki67、CD34蛋白、VEGF和VEGFR2蛋白、eNOS、NO)表达下调(P0.05),凋亡相关蛋白(caspase3、cleaved-caspase3和Bax蛋白)表达上调(P0.05),PI3K/AKT信号通路相关蛋白(p-PI3K和p-AKT蛋白)表达下调(P0.05)。结论PAB在体外和体内有较强的抗多房棘球绦虫作用,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路,导致细胞凋亡增加和血管生成减少有关。