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丹参酮IIA对多房棘球蚴原头节体外活性及生长的影响

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中国病原生物学杂志 2023年第6期18卷 689-694页

作者：彭妍贾云超卓怡呈多小勇张示杰石河子大学医学院新疆石河子832000 石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科

目的探究丹参酮IIA对多房棘球蚴原头节体外活性及生长的影响。方法从沙鼠体内获取多房棘球蚴原头节并在体外培养3d后分别与250、500、1000μmol/L丹参酮IIA共培养7d,以DMEM为空白对照组,DMSO为溶剂对照组,显微镜下观察各组原头节形态及... 详细信息

目的探究丹参酮IIA对多房棘球蚴原头节体外活性及生长的影响。方法从沙鼠体内获取多房棘球蚴原头节并在体外培养3d后分别与250、500、1000μmol/L丹参酮IIA共培养7d,以DMEM为空白对照组,DMSO为溶剂对照组,显微镜下观察各组原头节形态及活性(活性良好的原头节不被伊红染色),计算存活率并绘制活力曲线;共培养24h后用活性氧(ROS)测定试剂盒测定各组原头节的ROS水平;共培养2d后用Westernblot检测各组原头节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3相对表达量;扫描电镜观察共培养2d时各组原头节表面显微结构。多房棘球蚴原头节与大鼠肝癌细胞共培养8~9周形成多房棘球蚴囊泡,囊泡分别与两对照组、250、500、1000μmol/L丹参酮IIA共培养2 d,扫描电镜观察囊泡生发层显微结构。结果原头节与250、500、1000μmol/L丹参酮IIA共培养2d,随着药物浓度的升高原头节形态结构发生改变,虫体模糊不清且红染率升高,原头节活性受抑制;共培养2d时空白对照组、溶剂对照组活力分别为100%、(98.53±0.503)%,250、500和1000μmol/L组多房棘球蚴原头节活力分别为(81.00±3.606)%、(63.97±3.275)%、(37.07±3.296)%(F=298.1,P原头节活力分别为(98.33±0.577)%、(93.90±0.529)%,250和500μmol/L组多房棘球蚴原头节活力分别为(51.67±7.638)%、(9.37±6.075)%,均低于对照组(P原头节均死亡。共培养24h,各浓度丹参酮IIA组原头节ROS水平显著高于对照组(均P原头节Bcl-2表达减少,Bax和Caspase-3表达升高(均P原头节显微结构出现不同程度破坏甚至破裂,空白对照组和溶剂对照组原头节结构正常;不同浓度丹参酮IIA与囊泡共培养2d后扫描电镜观察囊泡生发层显微结构,可见生发层细胞不同程度地出现脱落、破裂。空白对照组和溶剂对照组生发层细胞包膜完整、形态饱满,并可见大量小的生发囊。结论丹参酮IIA对多房棘球蚴原头节体外活性及生长具有抑制作用,该抑制作用可能与丹参酮IIA打破原头节抗氧化防御系统的平衡、诱导细胞凋亡及抑制生发层细胞生长有关。

关键词：多房棘球蚴原头节丹参酮IIA 凋亡

MEK1/2抑制剂曲美替尼对体外多房棘球蚴原头节的作用研究

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中国人兽共患病学报 2022年第8期38卷 673-677页

作者：李德伟施阳李亮侯昕伶王慧张传山李静新疆医科大学基础医学院乌鲁木齐830054 新疆医科大学第一附属医院/临床医学研究院省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室新疆包虫病基础医学重点实验室乌鲁木齐830054

目的研究MEK1/2抑制剂曲美替尼对体外多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)活性的影响,探讨MEK1/2作为治疗泡型棘球蚴病靶点的可能性。方法建立Em空白对照组、DMSO及1μmol/L、50μmol/L、100μmol/L曲美替尼组,利用活力染色... 详细信息

目的研究MEK1/2抑制剂曲美替尼对体外多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)活性的影响,探讨MEK1/2作为治疗泡型棘球蚴病靶点的可能性。方法建立Em空白对照组、DMSO及1μmol/L、50μmol/L、100μmol/L曲美替尼组,利用活力染色与扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)分别观察虫体活性及体表结构变化;以Swiss Model同源建模合理构建Em MEK1/2分子的三级结构进行分析。结果1μmol/L曲美替尼干预3 d、6 d、9 d的原头节活性分别为(84.72±0.27)%、(87.32±2.01)%、(85.12±3.64)%,低于相同时间DMSO组,且差异有统计学意义(t>2.78,P原头节活性降至(37.82±2.12)%,与DMSO组比较差异具有统计学意义(t=32.90,P<0.01)。SEM和活力染色显示曲美替尼组虫体活性与干预浓度成正比,同源建模结果显示Em与人MEK1/2分子具有较高的同源性。结论综合分析活力染色、SEM与同源建模结果,证实体外1μmol/L的MEK1/2抑制剂曲美替尼对虫体活性具有较好的抑制作用,为临床治疗提供了理论依据。

关键词：多房棘球蚴 MEK信号通路曲美替尼体外培养原头节

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黄杨碱体外抗细粒棘球蚴原头节作用的研究

黄杨碱体外抗细粒棘球蚴原头节作用的研究

作者：孟凯青海大学

学位级别：硕士

目的:观察黄杨碱、黄杨碱联合阿苯达唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节活性的影响,并进一步探究黄杨碱抗细粒棘球蚴原头节的作用机制。方法:在无菌条件下,取新鲜处死的感染囊型棘球蚴病的羊肝组织,收集得到细粒棘球蚴原头节,将原头节培养... 详细信息

目的:观察黄杨碱、黄杨碱联合阿苯达唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节活性的影响,并进一步探究黄杨碱抗细粒棘球蚴原头节的作用机制。方法:在无菌条件下,取新鲜处死的感染囊型棘球蚴病的羊肝组织,收集得到细粒棘球蚴原头节,将原头节培养在含有10%胎牛血清、100U/m L青霉素和100U/m L链霉素的RPMI-1640培养基中,并置于37℃、5%CO培养箱内培养待用。将不同浓度的黄杨碱（20、40、80、120、160μmol/L）、阿苯达唑（50μmol/L）、黄杨碱联合阿苯达唑（20μmol/L+50μmol/L）分别和细粒棘球蚴原头节培养,在培养的第6小时、第12小时、第1天、第3天、第5天、第7天、第9天,分别用台盼兰染色,镜下观察原头节活力,实验独立重复3次,计算原头节的死亡率并绘制原头节活力曲线图;运用Western Blot技术检测黄杨碱对体外细粒棘球蚴原头节中Bax、Bcl-2蛋白表达的变化;运用活性检测试剂盒检测黄杨碱对原头节中Caspase-3、Caspase-9蛋白活性的影响;运用JC-1试剂盒检测原头节细胞中线粒体膜电位变化;运用透射电镜（TEM）观察原头节内部超微结构的改变。结果:体外培养细粒棘球蚴原头节1d后,空白对照组和DMSO组的原头节活性率无明显变化,分别为98.33±2.08%和98.67±1.53%,不同浓度的黄杨碱（20、40、80、120和160μmol/L）处理后的原头节活性率为80.67±4.16%、57.00±4.58%、32.67±4.04%、24.67±3.51%和16.00±2.65%,表明黄杨碱可有效抑制体外细粒棘球蚴原头节的生长,且呈现出时间和浓度依赖性。以原头节活性率为25%作为终点比较,阿苯达唑组（50μmol/L）、低浓度黄杨碱组（20μmol/L）用时均约7天,而联合用药组（20μmol/L黄杨碱+50μmol/L阿苯达唑）用时约3天,且各组体外作用原头节9天后,原头节活性率分别为17.00±4.36%、12.00±2.00%和0.33±0.18%,表明联合用药组相较于单药组更能有效抑制原头节生长,且起效更快。不同浓度的黄杨碱（40、80、120μmol/L）处理原头节1天后,Bax蛋白表达、Caspase-3与Caspase-9蛋白活性较空白对照组、DMSO组增高,Bcl-2蛋白表达降低,呈现出浓度依赖性,具有统计学意义（p原头节细胞线粒体膜电位未见明显差异,不同浓度黄杨碱组（40、80、120μmol/L）的原头节细胞线粒体膜电位随药物浓度下调,具有统计学意义（p原头节细胞内各种结构完整,在加入不同浓度的黄杨碱（40、80、120μmol/L）培养后,细胞内各种结构松散,凋亡小体增加,且随着黄杨碱浓度增加,这些变化更加严重。结论:1.黄杨碱能有效抑制体外细粒棘球蚴原头节的生长,且呈现出时间和浓度依赖性。2.黄杨碱联合阿苯达唑能有效抑制体外细粒棘球蚴原头节的生长,且起效更快。3.黄杨碱可能通过线粒体途径诱导细粒棘球蚴原头节凋亡。

关键词：黄杨碱体外细粒棘球蚴原头节凋亡

多房棘球绦虫原头节cDNA表达文库的构建及初步鉴定(英文)

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Chinese Medical Journal 2001年第2期114卷 12-15,103页

作者：李淑萍陈雅棠重庆医科大学传染病与寄生虫病研究所重庆400016

目的　构建中国分离株多房棘球绦虫原头节cDNA表达文库。方法　mRNA的提取采用QuicprepMicromRNApurificationkit并做适当改进 ,主要利用异硫氰酸胍的破坏和保护双重作用及oligo(dT) 纤维素柱层析来提取、纯化mRNA。以约 1 8μg的mRNA... 详细信息

目的　构建中国分离株多房棘球绦虫原头节cDNA表达文库。方法　mRNA的提取采用QuicprepMicromRNApurificationkit并做适当改进 ,主要利用异硫氰酸胍的破坏和保护双重作用及oligo(dT) 纤维素柱层析来提取、纯化mRNA。以约 1 8μg的mRNA为模板、六聚体随机引物逆转录 ,再用衔接头EcoRI/NotI修饰逆转录所得的cDNA钝端以使其两端形成粘性EcoRI位点 ,然后克隆入噬菌体λgtll的EcoRI臂 ,体外包装后转染大肠杆菌Y10 90 ,蓝白斑筛选重组体 ,PCR鉴定插入片段大小。结果　重组率几乎 10 0 % ;库容量约 1× 10 6 ,插入片段长为 1 4 7Kb。结论　已成功构建中国分离株多房棘球绦虫原头节cDNA表达文库 ,可进行进一步的深入研究。

关键词：多房棘球绦虫原头节噬菌体λgtll cDNA表达文库克隆

氨基醇类化合物HT24对多房棘球蚴原头节微管蛋白表达水平的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2021年第4期39卷 437-442,448页

作者：史琦琪刘丛珊霍乐乐魏玉芬姜斌殷梦薛剑陶奕张皓冰中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心国家级热带病国际联合研究中心上海200025

目的探索氨基醇类化合物HT24对多房棘球蚴原头节微管蛋白表达水平的影响。方法从感染多房棘球蚴的BALB/c小鼠体内分离原头节,体外培养1 d后分为对照组和低、中、高浓度组,分别加入终浓度0.5%的二甲基亚砜(DMSO)和25、50、100μmol/L的H... 详细信息

目的探索氨基醇类化合物HT24对多房棘球蚴原头节微管蛋白表达水平的影响。方法从感染多房棘球蚴的BALB/c小鼠体内分离原头节,体外培养1 d后分为对照组和低、中、高浓度组,分别加入终浓度0.5%的二甲基亚砜(DMSO)和25、50、100μmol/L的HT24共培养,每组设3个平行孔,每孔含原头节约2000个。HT24作用后第1~3天观察虫体活性及形态改变,第3天透射电镜下观察原头节焰细胞超微结构的变化情况,第3、5、7天实时荧光定量PCR(qPCR)检测原头节中α9-,β2-,β4-和β6-微管蛋白基因的mRNA相对转录水平,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测原头节中β-微管蛋白的相对表达量。组间比较使用双因素方差分析方法。结果氨基醇类化合物HT24作用后第3天,低浓度组多房棘球蚴原头节轮廓模糊,虫体胀大,透明度降低,部分钩突脱落;中浓度组原头节明显胀大,钩突脱落;高浓度组原头节全部死亡,虫体缩小。透射电镜观察结果显示,中、高浓度组焰细胞胞膜破裂,胞质内纤毛断裂,出现大的缺口或断裂口,部分纤毛溢出,游离于细胞外。qPCR结果显示,相较于对照组(100),低、中、高浓度组第7天α9-微管蛋白基因mRNA相对转录水平分别为8.01±1.54、9.84±0.40和7.85±2.60,3组间差异有统计学意义(P原头节微管蛋白基因mRNA和蛋白的表达水平,影响微管蛋白功能,从而抑制多房棘球蚴的生存。

关键词：多房棘球绦虫氨基醇类化合物原头节微管蛋白

细粒棘球蚴原头节分泌的细胞外囊泡中人源蛋白质组学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2020年第6期38卷 695-701页

作者：史春丽杨慧潘雯张馨朱晓庭赵嘉庆宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学医学科学技术研究中心银川750004 宁夏回族自治区医学科学研究所银川750004 宁夏医科大学临床医学院银川750004

目的蛋白质组学分析鉴定来源于细粒棘球蚴原头节分泌的细胞外囊泡(EVs)中人源蛋白质的组分。方法收集细粒棘球蚴病患者肝脏中的完整包囊,无菌条件下分离原头节,用含30%去外泌体的胎牛血清完全培养基体外培养原头节,每3天换1次培养基并... 详细信息

目的蛋白质组学分析鉴定来源于细粒棘球蚴原头节分泌的细胞外囊泡(EVs)中人源蛋白质的组分。方法收集细粒棘球蚴病患者肝脏中的完整包囊,无菌条件下分离原头节,用含30%去外泌体的胎牛血清完全培养基体外培养原头节,每3天换1次培养基并收集培养上清,用EVs分离试剂盒分离培养上清中的EVs。透射电镜观察EVs的形态;纳米粒子跟踪分析EVs的粒径;采用液相色谱-质谱法对EVs进行蛋白质组学测序,二级质谱数据使用Maxquant(v1.***.2.8)进行蛋白检索与注释。将人源蛋白通过在线工具David进行组织、疾病及通路的富集比对与注释。结果体外培养原头节分泌的EVs为杯状双层膜性囊泡,直径小于200 nm。蛋白质组学测序共测出20317条肽段,鉴定获得1461个蛋白,其中328个为人源蛋白。原头节分泌的EVs中高度富集的外泌体标志蛋白有细丝蛋白、14-3-3蛋白、热休克蛋白90、热休克蛋白70和丙酮酸激酶。EVs的人源蛋白中,组织富集程度居前3位的为血浆、Cajal-Retzius细胞、肝脏。疾病富集中涉及感染、免疫和癌症等相关疾病。Bio Carta通路富集结果显示,富集程度居前3位的分别为替代补体通路、凝集素补体通路和补体通路;KEGG通路富集程度居前3位的为黏着斑黏附信号通路、细胞外基质受体相互作用通路和蛋白酶体相互作用通路。结论体外培养原头节分泌的EVs中的人源蛋白与人体血浆和肝脏等组织相关,提示原头节通过分泌EVs与人体进行物质交换。

关键词：细粒棘球蚴原头节细胞外囊泡免疫逃逸蛋白质组学

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第3期34卷 208-213页

作者：赵殷奇李子华王浩朱明星牛楠王娅娜赵嘉庆李娜佟雪琪宋佳卉赵巍宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学包虫病实验室银川750004 宁夏医科大学科技中心银川750004 宁夏医科大学基础医学院病原与免疫教研室银川750004 宁夏医科大学临床学院检验系银川750004 宁夏医科大学基础医学院遗传与细胞生物教研室银川750004

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘... 详细信息

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。

关键词：细粒棘球绦虫原头节重组蛋白rEg-01883 原核表达免疫原性

过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡的实验观察

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第5期26卷 332-337页

作者：康金凤胡汉华白山别克陈蓉阿不力孜新疆医科大学乌鲁木齐830054 乌鲁木齐动物卫生监督所乌鲁木齐830054

目的探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。方法体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI1640组及RPMI1640添加谷氨酰胺组。分别用不同浓度的H2O2诱导,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(... 详细信息

目的探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。方法体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI1640组及RPMI1640添加谷氨酰胺组。分别用不同浓度的H2O2诱导,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测凋亡细胞;用过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色-免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)以及FAS基因蛋白(跨膜蛋白Fas)表达情况。表达产物用二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染。TUNEL反应以细胞核黄染者为阳性细胞,caspase-1和cas-pase-3以细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,Fas以细胞膜和细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,无黄染者为阴性细胞。根据每个原头节中阳性细胞数所占百分比,对原头节阳性表达程度分为4个级别,即原头节中阳性细胞数50%为"+++"。实验重复2次。各组均设空白对照组。结果RPMI1640组,1mmol/LH2O2诱导12h,查见典型的TUNEL反应阳性细胞;诱导4h,caspase-1表达86.6%为"+～++",cas-pase-3表达77.8%为"+～++";诱导8h,caspase-1表达86.6%为"+～++",caspase-3表达80.0%为"+～++"。均比对照组明显增加(P原头节在对照组和诱导组均可见Fas阳性表达细胞,RPMI1640组5mmol/LH2O2诱导4h,"+～++"表达为53.0%,对照组为20.0%;RPMI1640添加谷氨酰胺组5mmol/LH2O2诱导8h,"+～++"表达为88.7%,对照组为71.4%,诱导后均有所增加(P原头节细胞凋亡。

关键词：细粒棘球绦虫原头节过氧化氢细胞凋亡半胱天冬氨酸蛋白酶 FAS基因基因表达

大叶桉桉叶提取物对细粒棘球绦虫原头节的体外杀虫作用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第3期34卷 266-271页

作者：赵宇宁张皓冰中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、世界卫生组织热带病合作中心、科技部国家级热带病国际联合研究中心、卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

目的探索大叶桉（Eucalyptus robusta）桉叶提取物体外抗细粒棘球绦虫原头节的活性。方法 2012年1-12月每月24日收集大叶桉成熟叶片，室内自然风干。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和无水乙醇等4种不同极性的溶剂进行超声提取。将不同... 详细信息

目的探索大叶桉（Eucalyptus robusta）桉叶提取物体外抗细粒棘球绦虫原头节的活性。方法 2012年1-12月每月24日收集大叶桉成熟叶片，室内自然风干。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和无水乙醇等4种不同极性的溶剂进行超声提取。将不同浓度的提取物与原头节孵育72 h，计算虫体死亡率，计算半数致死浓度（LC50）。结果不同溶剂提取物的性状和产率均不同，石油醚提取物为棕黑色油膏状，二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇提取物分别为墨绿色、乳粉色和乳白色粉末状。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇提取物的平均产率分别为4.4%、2.1%、2.3%和2.3%，石油醚提取物的产率最高，其5月份的产率为5.4%。作用浓度为100 μg/ml时，各月份桉叶的石油醚与二氯甲烷提取物对原头节的杀灭作用均达到100%；50 μg/ml时，石油醚提取物的杀灭作用也基本达到100%，二氯甲烷提取物次之，强于乙酸乙酯和无水乙醇提取物。对石油醚和二氯甲烷提取物作进一步研究，结果显示，各月份石油醚提取物对原头节的杀灭作用由强到弱依次为6〉3〉11〉4〉2〉5〉10〉8〉12〉7〉1〉9，其中6月份提取物的作用最强，LC50为2.577 μg/ml，95%置信区间为0.85～6.22 μg/ml；各月份二氯甲烷提取物的杀灭作用由强到弱依次为：11〉5〉10〉4〉7〉12〉6〉9〉8〉2〉3〉1，其中11月份的作用最强，LC50为21.85 μg/ml，95%置信区间为12.38～36.28 μg/ml。结论大叶桉桉叶中含有抗细粒棘球蚴的活性成分，值得做进一步的分离、分析和鉴定。

关键词：大叶桉细粒棘球蚴原头节半数致死浓度