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基于CHO-K1细胞稳定表达的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 135-142页

作者：蒋智勇蔡汝健李艳郭怡德楚品品宋帅勾红潮李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩... 详细信息

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过Western-blot验证其反应原性。结果表明,ASFV CD2v蛋白在CHO-K1细胞中被成功表达,并能与ASFV抗体阳性血清反应。以纯化的GFP-CD2v重组蛋白为包被抗原建立检测ASFV CD2v蛋白抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原最佳包被质量浓度为1.25μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳稀释度为1∶50000,以此建立的ASFVCD2v蛋白的间接ELISA方法临界值为0.31;该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒等病毒抗体阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性较强;用该ELISA方法检测阳性血清敏感性可达1∶1600;批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本试验中建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV抗体的检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 CD2v CHO-K1细胞稳定表达间接ELISA

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用

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中国动物传染病学报 2023年第2期31卷 114-119页

作者：张昆丽席振军徐民生李艳勾红潮楚品品蔡汝健李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×... 详细信息

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR 检测方法

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

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广东农业科学 2022年第4期49卷 97-105页

作者：蒋智勇楚品品陈天宝李春玲蔡汝健广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集... 详细信息

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集521份患病猪组织样本进行PRRSV检测。对样本进行ORF5基因测序,采用DNAStar分析ORF5核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用Mega7.0构建基于ORF5基因的系统遗传进化树。【结果】从37个猪场采集的样品PRRSV阳性率为24.4%,猪场阳性率为45.9%。通过测序分析获得17株来自不同猪场的PRRSV ORF5基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株(PRRSV 2),其中有5株属于Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like)谱系,9株属于Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like)谱系,3株属于Lineage 3(QYYZ-like)谱系,没有监测到Lineage 5(VR2332-like)谱系的毒株。17株PRRSV毒株的ORF5基因之间核苷酸序列同源性为81.3%~99.5%,推导的氨基酸序列同源性为80.0%~98.3%。【结论】2021年广东省PRRSV流行株以Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like)和Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like)谱系为主,占比分别为52.94%和29.41%,Lineage 3(QYYZ-like)谱系降为次要流行株,占比为17.65%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因 NADC30毒株 NADC34毒株遗传变异

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

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中国畜牧兽医 2022年第11期49卷 4356-4363页

作者：楚品品蒋智勇李春玲勾红潮李艳蔡汝健广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

【目的】研究纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)PRRSV(0.0001~0.1)黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5μg/mL,0.375、0.75、1.5μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间(3、6、12、18、24 h)加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。

关键词：纳米银(AgNPs) 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 抗病毒活性作用机制

非洲猪瘟病毒防污染双重荧光定量PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2023年第1期44卷 19-26页

作者：卞志标郭怡德席振军柯海意蔡汝健孙铭飞勾红潮李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640

荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的... 详细信息

荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的检测方法将无法满足野毒株与变异株鉴别检测的需求。为了解决qPCR易产生假阳性,ASFV核酸检测靶标基因过分单一的问题,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。该检测方法根据C962R基因和MGF-505-2R基因的保守序列设计引物和探针,并在反应体系中加入UNG酶达到防污染的目的,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。结果表明,利用该方法对C962R基因和MGF-505-2R的基因标准品进行检测,该检测方法具有较好的鉴别诊断效果。该检测方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.99;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL的ASFV基因标准品;特异性强,与猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(Hoemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)均无交叉反应;重复性较好,变异系数小于1.75%,使用该检测方法对194份临床组织样品检测,与商品化非洲猪瘟病毒抗原检测试剂盒比较,检测结果均为阴性,符合率为100%。该方法预期可用于ASFV野毒株与MGF-505-2R基因缺失株的鉴别诊断,为深入开展分子流行病学调查提供技术储备。

关键词：非洲猪瘟病毒荧光定量聚合酶链反应 MGF-505-2R基因

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我国新城疫分子流行病学研究进展

广东农业科学 2023年第2期50卷 115-124页

作者：连聪温肖会吕殿红高小鹏贾春玲周秀蓉常琦罗胜军广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站/岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心广东广州510640

新城疫(Newcastle Disease,ND)是严重损害禽类健康的疾病之一,在世界范围内广泛流行,临床以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜出血等症状为特征,严重危害禽类的生长繁殖及禽肉生产。新城疫由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV... 详细信息

新城疫(Newcastle Disease,ND)是严重损害禽类健康的疾病之一,在世界范围内广泛流行,临床以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜出血等症状为特征,严重危害禽类的生长繁殖及禽肉生产。新城疫由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起。NDV已有近100年的流行历史,能够感染鸡、鸭、鹅和鸽子等200多种禽类,其基因型众多,易变的基因型给新城疫防控带来巨大困难。鸟类迁徙在病毒跨境传播中起到重要作用,导致我国各地区新城疫疫情时有发生,给养禽业带来巨大的经济损失,严重制约了养禽业的健康发展。NDV分布范围广、宿主流动性强,是危害养禽业的重要病毒。为了解我国NDV的流行情况,通过对其分子流行病学及各基因型的时空分布进行分析,发现我国新城疫主要分布于广西、广东等华南地区,江苏、安徽等华东地区及陕西、甘肃等西北地区。这些地区分离出的高致病性Ⅱ类毒株包括多种基因型,其中基因Ⅱ型和基因Ⅶ型毒株为主要流行株。通过对NDV流行相关数据的整理与分析可为疫情防控和疫苗研究提供参考。

关键词：家禽新城疫基因分型分子流行病学疾病防治

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旋毛虫免疫逃避机制的研究进展

中国人兽共患病学报 2024年第1期40卷 70-75页

作者：钱艳红宋帅温肖会贾春玲吕殿红袁子国罗胜军华南农业大学兽医学院广州510642 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种全球分布的食源性人兽共患寄生虫病,对动物生产和人兽公共卫生安全造成严重危害。旋毛虫发育史复杂,整个生命周期都在同一宿主体内完成,为了能与宿主相互共存,其进化出各种免疫逃避机制来躲避宿主的免疫清... 详细信息

旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种全球分布的食源性人兽共患寄生虫病,对动物生产和人兽公共卫生安全造成严重危害。旋毛虫发育史复杂,整个生命周期都在同一宿主体内完成,为了能与宿主相互共存,其进化出各种免疫逃避机制来躲避宿主的免疫清除,从而建立长期的慢性感染。本研究从旋毛虫抗原变异、对宿主的免疫调节作用和通过形成包囊产生免疫隔离3个方面,对其免疫逃避机制进行阐述,将为深入了解旋毛虫的致病机制提供重要帮助。

关键词：旋毛虫感染免疫逃避

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法建立与应用

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中国动物传染病学报 2021年

作者：张昆丽席振军徐民生李艳勾红潮楚品品蔡汝健李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌（APP）检测方法，本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4（APxⅣ）序列合成特异性引物，通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示，该纳米PCR对APP的检测... 详细信息

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌（APP）检测方法，本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4（APxⅣ）序列合成特异性引物，通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示，该纳米PCR对APP的检测下限为1 × 10;CFU/mL，其灵敏度是普通PCR的10倍。且特异性结果显示，该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带，而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性。最后应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料，结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07％（7/41）和19.51％（8/41），以上结果表明，本研究成功建立的APP的纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好，可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR 检测方法

广东省鸭疫里默氏杆菌流行病学监测及遗传进化关系

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华南农业大学学报 2022年第2期43卷 1-10页

作者：吴彩艳廖申权戚南山廖晓萍孙阮洋方亮星周宇峰李林林孙铭飞华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东省农业科学院动物卫生研究所/岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心/广东省兽医公共卫生公共实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640

【目的】明确广东地区鸭疫里默杆菌Riemerella anatipestifer的血清型、耐药状况及遗传进化关系。【方法】从规模化鸭场分离鉴定鸭疫里默氏杆菌,通过玻片凝集试验鉴定血清型;利用试管两倍稀释法测试抗菌药物的最低抑菌浓度,分析药物的... 详细信息

【目的】明确广东地区鸭疫里默杆菌Riemerella anatipestifer的血清型、耐药状况及遗传进化关系。【方法】从规模化鸭场分离鉴定鸭疫里默氏杆菌,通过玻片凝集试验鉴定血清型;利用试管两倍稀释法测试抗菌药物的最低抑菌浓度,分析药物的敏感性;采用全基因组测序技术分析序列特征并构建核心基因组遗传进化树。【结果】共分离鉴定鸭疫里默氏杆菌168株,血清1、2、3、5、6、7、8、10型均有流行,血清1型的菌株高达54.17%(91/168),其次为2型,占27.97%(47/168)。48株代表性菌株对庆大霉素、卡那霉素、盐酸环丙沙星表现高度耐药,耐药率均超过80%;对土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的耐药率均在60%以上;对阿莫西林、头孢噻肟和大观霉素的耐药率低于30%。受试菌株对5~12种药物耐药,共有44种耐药谱型。成功获得46株菌株全基因组序列,共检出6种耐药基因,其中,耐药基因erm(F)和tet(X)的检出率较高,分别为73.91%(34/46)和82.60%(38/46),同时携带2种以上耐药基因的菌株占95.65%(44/46)。18株(39.13%,18/46)菌株ST分型成功,分属11个ST型。所有测序菌株与数据库中来自中国的菌株在遗传进化关系上最接近,主要存在于优势克隆群系Clade 1和Clade 3中。【结论】本研究鸭疫里默氏杆菌分离株的优势血清型为1型,耐药性严重,所携带的耐药基因与耐药表型具有一定相关性,ST型呈多样性,与多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)数据库中来自我国菌株的遗传背景相近。研究结果可为鸭疫里默氏杆菌病疫苗免疫预防与药物治疗提供依据,有助于掌握鸭疫里默氏杆菌遗传进化特征。

关键词：鸭疫里默氏杆菌血清型耐药性遗传进化流行病学