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毛细管电泳测定micro RNA346基因多态性的方法研究

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四川大学学报（医学版） 2018年第2期49卷 280-284页

作者：任冬霞曹一凡孙成均周琛王丽梅李永新四川大学华西公共卫生学院卫生检验与检疫系成都610041 四川省食品安全监测与风险评估重点实验室成都610041

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳(CE)测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA,PCR扩增micro RNA346目的基因,BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切,产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电... 详细信息

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳(CE)测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA,PCR扩增micro RNA346目的基因,BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切,产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电压等参数进行了优化。在优化的条件下(筛分介质质量浓度为10g/L分离电压为12kV),分别测定类风湿性关节炎患者和正常人血清样品micro RNA346酶切产物,并对其进行基因分型。结果在优化的CE实验条件下(筛分介质质量浓度为10g/L,分离电压为12kV,25min内可完成micro RNA346基因酶切产物检测。方法日内相对标准偏差(RSD)为0.43%~0.63%,日间RSD为1.49%~1.56%。用该法测定了96份类风湿性关节炎患者样品和43份正常人样品,结果均为micro RNA346Ⅰ型,未发现micro RNA346Ⅱ型。结论本研究建立的方法操作简单,具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点,适用于micro RNA类小分子RNA基因多态性的测定。

关键词：毛细管电泳法基因多态性 micro RNA346 类风湿性关节炎

柱前紫外衍生-高效液相色谱法同时测定功能食品中八种糖醇和糖

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四川大学学报（医学版） 2014年第5期45卷 831-835页

作者：刘亚攀冉雪琴陈璐莹张静阮佳李永新孙成均四川大学华西公共卫生学院卫生检验与检疫系成都610041 四川省食品安全监测与风险评估重点实验室成都610041

目的建立功能食品中赤藓糖醇、木糖醇、半乳糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇,以及葡萄糖和三氯蔗糖的柱前紫外衍生-高效液相色谱同时测定方法。方法食品中的糖醇等经水提取后,与苯甲酰氯反应生成紫外衍生物,衍生物经C18柱分离,柱温为30... 详细信息

目的建立功能食品中赤藓糖醇、木糖醇、半乳糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇,以及葡萄糖和三氯蔗糖的柱前紫外衍生-高效液相色谱同时测定方法。方法食品中的糖醇等经水提取后,与苯甲酰氯反应生成紫外衍生物,衍生物经C18柱分离,柱温为30℃,甲醇-水梯度洗脱,流速1.00mL/min,检测波长为232nm。结果所测8种物质的标准曲线线性良好（r〉0.999）,检出限低于2.2μg/mL,加标回收率为89.6%~117.0%,日内相对标准偏差小于5%。结论该方法衍生反应简便快速、所需试剂经济易得,本法不需特殊检测器,易于推广,适用于功能食品中多种糖醇的同时测定。

关键词：糖醇苯甲酰氯柱前紫外衍生高效液相色谱法功能食品

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Pig-a基因突变试验研究与应用进展

中国药理学与毒理学杂志 2015年第1期29卷 174-178页

作者：霍娇李岩陈锦瑶张立实四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室四川成都610041

Pig-a基因位于人类X染色体短臂,参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的早期合成。Pig-a基因突变后不能正常合成GPI连接蛋白,致使细胞表型缺失,是阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病的分子机制。该特性被应用于一项新的体内致突变试验——Pig-a... 详细信息

Pig-a基因位于人类X染色体短臂,参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的早期合成。Pig-a基因突变后不能正常合成GPI连接蛋白,致使细胞表型缺失,是阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病的分子机制。该特性被应用于一项新的体内致突变试验——Pig-a基因突变试验:动物经过一次或多次染毒,一段时间后收集少量目标细胞,即可采用流式细胞术或有限稀释法对细胞突变频率进行定量检测,从而判定化学物的致突变性。Pig-a基因突变试验具有相对快捷、样品需求量小、可与重复毒性试验相结合的优势,能够更为全面可靠地评价受试物遗传毒性,被认为具有良好的应用前景。

关键词： Pig-a基因遗传毒性突变

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌

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分析化学 2008年第12期36卷 1667-1671页

作者：李永新黎源倩渠凌丽何成艳四川大学华西公共卫生学院卫生检验教研室

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增... 详细信息

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重PCR扩增产物。优化了多重PCR扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件。当芯片电泳的筛分介质HPMC-50浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmol/L、电场强度为120 V/cm时,pUC Mix DNAMarker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%~2.09%。本方法能够检出1×102cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌O157:H7和志贺菌。方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段。将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义。

关键词：微流控芯片激光诱导荧光检测食源性致病菌多重聚合酶链反应

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

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南方医科大学学报 2015年第1期35卷 23-28页

作者：金燕张薇薇王溯源叶正茂张立实裴晓方四川大学华西公共卫生学院卫生检验与检疫学系四川成都610041 成都医学院公共卫生系四川成都610500 食品安全监测与风险评估四川省重点实验室四川成都610041

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（r DNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术... 详细信息

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（r DNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103CFU/ml,即104CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV〈1.5%）,该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P〉0.05）,实验过程仅需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。

关键词：产毒性真菌裸磁珠富集多重实时荧光定量PCR 辣椒模型

两种胚胎干细胞实验模型评价邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯胚胎发育毒性的比较研究

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中华预防医学杂志 2016年第7期50卷 645-651页

作者：罗莎方海琴杨辉张立实贾旭东四川大学华西公共卫生学院成都610041 卫生部食品安全风险评估重点实验室国家食品安全风险评估中心

目的：建立并应用小鼠胚胎干细胞实验（mEST）模型与人胚胎干细胞实验（hEST）模型评价邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的胚胎发育毒性。方法参照欧洲替代方法研究中心（ECVAM）的标准操作方法，建立mEST、hEST模型，并选用ECVAM... 详细信息

目的：建立并应用小鼠胚胎干细胞实验（mEST）模型与人胚胎干细胞实验（hEST）模型评价邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的胚胎发育毒性。方法参照欧洲替代方法研究中心（ECVAM）的标准操作方法，建立mEST、hEST模型，并选用ECVAM推荐的已知强胚胎发育毒性物质5-氟尿嘧啶（5-FU）和无胚胎毒性物质青霉素G（PN-G）进行模型验证，在模型验证有效的基础上，以15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μg/ml 浓度的DEHP分别染毒小鼠胚胎干细胞D3（mESC-D3）、Balb/c小鼠成纤维细胞3T3（3T3）及人胚胎干细胞H9（hESC-H9）7 d，采用CCK-8法检测不同浓度DEHP染毒后mESC-D3、3T3及hESC-H9细胞存活百分数和半数增殖抑制浓度（IC50）。根据细胞毒性实验结果，使用15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0μg/ml 浓度的DEHP分别处理分化的mESC-D3、hESC-H9细胞10 d，采用Real-time PCR检测不同浓度DEHP作用下，分化标志基因心肌细胞肌球蛋白重链（α-MHC）的表达情况，拟合效应曲线，得出半数分化抑制浓度（ID50）。并将ID50、IC50代入线性判别函数公式进行计算与比较。结果细胞生长状态良好，免疫荧光染色可见未分化hESC-H9细胞高表达、干性关键转录因子八聚体结合转录因子（OCT4）、阶段特异性胚胎抗原（SSEA-4）及肿瘤排斥抗原（Tra-1-60），细胞处于未分化状态。拟胚体大小均一、形态一致，可重复性高。采用ECVAM推荐已知发育毒性物质（5-FU和PN-G）对模型进行验证，所建模型有效，可用于受试物胚胎发育毒性的评价。DEHP对mESC-D3的IC50为210.0μg/ml、ID50为246.8μg/ml及对3T3的IC50为197.3μg/ml，代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为7.78、7.58、-7.79，因Ⅰ〉Ⅱ〉Ⅲ，mEST模型评价DEHP为无胚胎发育毒性。DEHP对hESC-H9的IC50为184.8μg/ml，ID50为84.3μg/ml及对3T3的IC50为195.4μg/ml，代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为3.21、5.77、-6.46，因Ⅱ〉Ⅰ〉Ⅲ， hEST模型评价DEHP为弱胚胎发育毒性。结论 hEST模型相对于mEST模型在评价受试物的弱胚胎发育毒性方面可能更为敏感。

关键词：二乙基己基邻苯二甲酸胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞实验人胚胎干细胞实验胚胎发育毒性评价

基于流式细胞术的大鼠骨髓网织红细胞微核实验方法的建立

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四川大学学报（医学版） 2020年第1期51卷 67-73页

作者：曾珠朱雪娇霍娇刘运杰彭子豪陈锦瑶张立实四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院营养食品卫生与毒理学系四川省食品安全监测与风险评估重点实验室

目的建立并验证大鼠骨髓网织红细胞(reticulocytes,RETs)微核的流式细胞术检测方法。方法选用CD71-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记骨髓网织红细胞,CD45-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记白细胞,核酸染料DRAQ5标记DNA,建立骨髓微核的流式细胞术检测方法。SD大鼠随机分为甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)、N-乙基-N-亚硝基脲(ethyl nitrosourea,ENU)和秋水仙素(colchicine,COL)染毒组,各组大鼠按染毒剂量不同再分为4亚组,每亚组5只。以染毒剂量为0,作为各组溶剂对照。染毒方案为间隔24 h两次经口给药。末次给药后24 h采集双侧股骨骨髓,采用本研究建立的基于流式细胞术的骨髓微核检测方法测定骨髓中的RETs微核率和RETs比例,并同时使用人工显微镜下计数方法进行检测。结果成功建立基于流式细胞术的骨髓微核检测方法。采用该方法检测20只溶剂对照大鼠骨髓微核率(背景微核率)为0.83‰±0.12‰,采用人工显微镜下计数微核的方法检测的溶剂对照大鼠背景微核率为1.43‰±0.44‰,基于流式细胞术计数骨髓微核的方法背景微核率更低,且更为稳定。两种方法均可检测到EMS、CP、ENU、COL染毒后RETs微核率呈染毒剂量依赖性上升趋势,RETs比例呈染毒剂量依赖性下降。两种方法检测4种受试物诱导的RETs微核率相关性良好(相关系数为0.834 3~0.913 7)。结论本实验建立的基于流式细胞术的骨髓微核检测方法具有操作简便、灵敏快捷、背景微核率较低等优势,是人工微核计数方法的良好替代,可应用于化学物的遗传毒性评价。

关键词：微核实验流式细胞术大鼠骨髓遗传毒性

使用体内多终点遗传毒性检测体系评估2-甲基呋喃的遗传毒性

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卫生研究 2019年第6期48卷 976-980,1000页

作者：霍娇刘运杰曾珠朱雪娇彭子豪陈锦瑶张立实四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室

目的使用体内遗传毒性综合评价体系(Pig-a基因突变试验、流式微核试验和彗星试验)检测2-甲基呋喃的体内遗传毒性。方法 30只SPF级雄性SD大鼠分为6组,染毒组连续3 d经口灌胃染毒2-甲基呋喃25、50、100和150 mg/kg,溶剂对照为植物油,阳性... 详细信息

目的使用体内遗传毒性综合评价体系(Pig-a基因突变试验、流式微核试验和彗星试验)检测2-甲基呋喃的体内遗传毒性。方法 30只SPF级雄性SD大鼠分为6组,染毒组连续3 d经口灌胃染毒2-甲基呋喃25、50、100和150 mg/kg,溶剂对照为植物油,阳性对照为80 mg/kg N-乙基-N-亚硝基脲。于试验第3 d给药后3 h进行外周血彗星试验;试验第0(灌胃前1日)、14和28 d进行Pig-a基因突变试验;试验第0、4 d进行外周血微核试验。结果彗星试验中150 mg/kg组彗尾DNA百分含量显著升高;Pig-a基因突变试验结果显示,第14、28 d所有染毒组成熟红细胞和网织红细胞突变率均未见显著升高;流式微核试验所有染毒组网织红细胞微核率未见显著升高。结论该实验条件下,2-甲基呋喃急性暴露具有诱变性的可能性较低。

关键词： 2-甲基呋喃 Pig-a基因突变试验微核试验彗星试验遗传毒性

超微粉碎对富硒绿茶理化性质及体外益生特性的影响

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食品与发酵工业 2024年

作者：娄云梦赵萌房翠兰叶发银赵国华喻俊磊雷琳西南大学食品科学学院重庆市九龙坡区疾病预防控制中心川渝共建特色食品重庆市实验室江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院

富硒绿茶作为一种高效安全的补硒食品备受关注。该文探讨了超微粉碎和普通粉碎对富硒绿茶组分、硒形态及粉体性质的影响差异，并研究超微富硒绿茶粉硒代氨基酸的释放规律及其体外益生特性。结果表明，超微粉碎可增加茶粉游离氨基酸、叶... 详细信息

富硒绿茶作为一种高效安全的补硒食品备受关注。该文探讨了超微粉碎和普通粉碎对富硒绿茶组分、硒形态及粉体性质的影响差异，并研究超微富硒绿茶粉硒代氨基酸的释放规律及其体外益生特性。结果表明，超微粉碎可增加茶粉游离氨基酸、叶绿素及总浸出物溶出，提升膨胀力及溶解度，但对其硒含量及形态无影响。体外模拟胃肠道消化结果显示，超微富硒绿茶粉硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸随消化时间延长，释放率逐渐上升；而硒代胱氨酸在肠消化阶段被还原为硒代半胱氨酸。经胃肠道消化后的超微富硒绿茶渣用人粪便进行体外发酵，与对照组（不添加茶渣）相比，发酵24 h后超微富硒绿茶粉（P1）粪浆上清液DPPH和ABTS阳离子自由基清除、FRAP铁离子还原能力明显提升，肠道菌群超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力提升至少3倍，总短链脂肪酸含量增加105%。微生物多样性分析表明，超微富硒绿茶粉可显著改善肠道菌群结构，降低厚壁菌门/拟杆菌门比值、嗜胆菌属和梭杆菌属的相对丰度，提示其具有缓解肥胖、肠道炎症等疾病的潜力。该研究为富硒茶产品超微化的研发及精深加工提供了一定的理论依据。

关键词：富硒绿茶超微粉碎硒代氨基酸短链脂肪酸肠道菌群