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表面展示传染性法氏囊病病毒vp2蛋白细菌样颗粒的构建与鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2024年第2期 65-71,78页

作者：洪新雅段姝宇兰奇官王瑞楠朱凡王春凤王建忠吉林农业大学动物医学院吉林省微生态制剂工程研究中心/动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118

为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)vp2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆vp2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建vp2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-vp2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV vp2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-vp2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-vp2进行鉴定。结果表明:vp2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×10~9颗粒)BLPs最大可负载约107μg vp2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV vp2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。

关键词：传染性法氏囊病 vp2蛋白细菌样颗粒细菌表面展示系统亚单位疫苗

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定及vp2蛋白的原核表达

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黑龙江畜牧兽医 2024年第12期 59-63,68,125页

作者：魏玲熊荣园王思怡梁洪龙冬梅杨国淋南充职业技术学院四川南充637131 川北医学院四川南充637100

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达vp2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对... 详细信息

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达vp2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对vp2蛋白进行诱导表达、可溶性分析、纯化及Western-blot鉴定。结果表明:从临床病料样本中分离到1株病毒,将该毒株接种鸭胚,鸭胚的死亡时间均集中在接种后的第48~72小时之间,死亡鸭胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体有大量出血点、鸭喙短小等短喙侏儒综合征的典型病变特征,将分离毒株命名为SCNC01株。SCNC01株不能凝集1%鸡红细胞,在其基因组DNA中可扩增出NGPV NS1基因序列,该序列与GenBank中的NGPV NS1基因序列相似性在90.6%~98.3%之间,SCNC01株与MK000549、MN415966、JF333590、KC996729、KT598506、MW929338等NGPV毒株处于同一分支,确定该毒株为NGPV。SCNC01株的ELD_(50)为1×10^(-4.5)/0.2 mL,可引起雏鸭出现运动障碍、食欲下降、精神萎靡、喙萎缩、舌头外翻、排白色稀便等临床症状甚至死亡。经IPTG诱导NGPV vp2蛋白获得了表达,且表达形式为包涵体,经His-Tag蛋白纯化柱纯化后,出现与目的蛋白大小一致的单一条带,该蛋白能与NGPV阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。说明试验成功分离到1株鸭源NGPV,并获得了具有良好反应原性的vp2蛋白。

关键词：鸭新型鹅细小病毒(NGPV) 病毒分离病毒鉴定短喙侏儒综合征 vp2蛋白原核表达

A型塞内卡病毒vp2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2024年第2期51卷 678-688页

作者：任建乐林铱婷姬康谭姗姗陈新新晋怡王颖牛胜梁立滨李俊平赵宇军田文霞山西农业大学动物医学学院太谷030801 北京索莱宝科技有限公司北京101102

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)vp2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将vp2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-vp2,... 详细信息

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)vp2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将vp2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-vp2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以vp2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组vp2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组vp2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定vp2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的vp2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和vp2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

关键词： A型塞内卡病毒(SVA) vp2蛋白原核表达多克隆抗体间接ELISA

猪细小病毒7型vp2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2024年第14期 56-60页

作者：吕紫欣张鑫杰薛少华黄喜荣刘建奎戴爱玲龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350002 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心福建龙岩364012 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建龙岩364012

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)vp2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5... 详细信息

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)vp2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 vp2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

关键词：猪细小病毒7型 vp2蛋白 Cap基因原核表达多克隆抗体

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抗鸡传染性贫血病毒vp2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

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中国兽药杂志 2024年第8期58卷 1-8页

作者：侯力丹薛麒王嘉孔冬妮吴宏举翟天舒邓永毛娅卿吴华伟孙瑶刘丹中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081 中牧实业股份有限公司北京100070

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的vp2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗vp2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交... 详细信息

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的vp2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗vp2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-vp2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗vp2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV vp2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：鸡传染性贫血病毒 vp2蛋白单克隆抗体间接免疫荧光

非洲马瘟病毒vp2蛋白的截短表达及免疫原性分析

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1087-1095页

作者：王轩莹范亚亚户鑫兵徐婧张鸿歌田占成苟惠天郑玉姝关贵全罗建勋殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院河南科技学院动物科技学院甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为评价非洲马瘟病毒（AHSV）vp2截短蛋白的免疫原性，以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板，分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502（编码1～502 aa）和p RSF-S2-1056（编码503～1056 aa），分别将其转入大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细... 详细信息

为评价非洲马瘟病毒（AHSV）vp2截短蛋白的免疫原性，以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板，分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502（编码1～502 aa）和p RSF-S2-1056（编码503～1056 aa），分别将其转入大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞中进行表达。将纯化后的重组蛋白免疫小鼠后，采用间接ELISA测定小鼠血清中特异性抗体水平，用流式细胞术检测小鼠脾T细胞亚群、CD4+和CD8+T细胞表达IFN-γ的水平。结果显示，与PBS对照组相比，各免疫组小鼠血清中特异性抗体水平均显著升高，脾内CD4+T和CD8+T细胞水平均显著升高；免疫组小鼠脾CD4+T和CD8+T细胞表达IFN-γ的水平均升高。结果表明，重组AHSV vp2截短蛋白对小鼠具有较好的免疫原性，为进一步研究vp2蛋白生物学功能及非洲马瘟病毒亚单位疫苗奠定了理论基础。

关键词：非洲马瘟病毒 vp2蛋白截短表达免疫原性

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GⅡ.4型诺如病毒vp2蛋白生物信息学分析

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现代食品科技 2023年第9期39卷 42-51页

作者：林鹏黄玉雯李学鹏励建荣渤海大学食品科学与工程学院渤海大学海洋研究院辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013

为了解诺如病毒vp2蛋白的生物学特征,该研究以当前诺如病毒GII.4型流行毒株vp2蛋白为研究对象,应用生物信息学软件对vp2蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位进行... 详细信息

为了解诺如病毒vp2蛋白的生物学特征,该研究以当前诺如病毒GII.4型流行毒株vp2蛋白为研究对象,应用生物信息学软件对vp2蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位进行预测分析。结果表明,诺如病毒流行毒株vp2蛋白为稳定的亲水性蛋白,平均等电点为10.47、吸水系数为-0.47、不稳定系数为47.91,碱性氨基酸约占含量的11.60%;该蛋白含有约43个潜在的磷酸化修饰位点和2个潜在的糖基化修饰位点;大多数毒株不存在跨膜区和信号肽,然而GI.3型诺如病毒vp2蛋白存在跨膜区和信号肽;诺如病毒vp2蛋白二级结构中α-螺旋平均占比38.17%、延伸链平均占比7.45%、β-折叠平均占比6.25%、无规则卷曲平均占比48.13%;三级结构预测模型的蛋白覆盖率为56.70%;平均存在8个潜在的蛋白质抗原决定簇和25个B细胞抗原表位。该研究运用生物信息学分析方法预测当前GII.4型诺如病毒流行毒株vp2蛋白的理化性质和结构等方面,为进一步深入研究诺如病毒vp2蛋白功能奠定了理论基础。

关键词：诺如病毒 vp2蛋白生物信息学

鸡传染性贫血病毒vp2蛋白单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 597-606页

作者：汪铭锐吴俊花王飞邵红霞钱琨叶建强秦爱建扬州大学兽医学院教育部禽类预防医学重点实验室扬州225009 扬州大学兽医学院江苏省动物预防医学重点实验室扬州225009 扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

拟制备针对鸡传染性贫血病毒(CIAV)vp2蛋白的单克隆抗体(mAb),为CIAV的诊断和病毒生物学特性研究提供有用制剂。以PCR技术扩增CIAV vp2基因并克隆到原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导表达。以原核表达的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂... 详细信息

拟制备针对鸡传染性贫血病毒(CIAV)vp2蛋白的单克隆抗体(mAb),为CIAV的诊断和病毒生物学特性研究提供有用制剂。以PCR技术扩增CIAV vp2基因并克隆到原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导表达。以原核表达的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术研制并筛选分泌抗CIAV vp2蛋白mAb的阳性杂交瘤细胞;采用截短表达CIAV vp2基因方法鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示:成功获得了1株能稳定分泌抗CIAV vp2蛋白mAb的杂交瘤细胞株,并命名为CIAV-vp2-4A12;亚类鉴定结果表明,该mAb重链为IgG_(1)型,轻链为kappa链;Western blot结果显示,该mAb可以识别大肠杆菌,Sf9细胞和转染pCAGGS-vp2-Flag的DF1细胞中表达的vp2蛋白。使用原核表达截短蛋白进行表位鉴定,发现该mAb识别抗原表位序列是^(155)KTVRW^(159),序列比对发现该表位在CIAV中高度保守。本研究成功制备了针对CIAV vp2蛋白的特异性mAb,并精确鉴定了其识别表位,为vp2蛋白功能的研究以及CIAV的诊断方法研发提供了有效工具。

关键词：鸡传染性贫血病毒 vp2蛋白单克隆抗体抗原表位

传染性法氏囊病毒vp2蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建和鉴定

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中国兽医学报 2022年第10期42卷 1963-1969页

作者：邵亚男冯嘉轩李金斗郭春红丁佳欣陈铭桦丁伟单春晖张頔丁壮吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

将传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)强毒株的保护性蛋白vp2替换新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白胞外域部分,利用杆状病毒表达系统,构建了含有IBDV候选抗原表位vp2蛋白的重组杆状病毒rBV-vp2,并通过... 详细信息

将传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)强毒株的保护性蛋白vp2替换新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白胞外域部分,利用杆状病毒表达系统,构建了含有IBDV候选抗原表位vp2蛋白的重组杆状病毒rBV-vp2,并通过间接免疫荧光试验鉴定杆状病毒蛋白表达正确。rBV-vp2与NDV-HN、NDV-F、NDV-M组装成病毒样颗粒(cVLPs),形成含有IBDV候选抗原表位的IBD-ND二联病毒样颗粒(IBD-ND cVLPs),利用Western blot鉴定cVLPs各组分蛋白,证明IBD-ND cVLPs各组分组装正确。IBD-ND cVLPs的构建可为我国养禽业提供一种绿色、安全且可一针多防的IBD-ND二联病毒样颗粒疫苗候选株。

关键词：新城疫病毒传染性法氏囊病毒 vp2蛋白病毒样颗粒