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中药止痛贴对骨癌痛大鼠脊髓背角MApK信号转导通路影响的实验性研究

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时珍国医国药 2013年第6期24卷 1517-1520页

作者：姜涌张文学史振广王文萍辽宁卫生职业技术学院辽宁沈阳110101 辽宁中医药大学辽宁沈阳110101

目的观察中药止痛贴对骨癌痛大鼠痛行为及脊髓背角神经节p-ERK和p-p38表达的影响。方法 108只180～220 g雌性Wistar大鼠随机分为3组,分别为空白对照组(Con组,n=24)、假手术组(Sham组,n=24)、骨癌痛模型组(Ca组,n=60),3组分别于手术前2 ... 详细信息

目的观察中药止痛贴对骨癌痛大鼠痛行为及脊髓背角神经节p-ERK和p-p38表达的影响。方法 108只180～220 g雌性Wistar大鼠随机分为3组,分别为空白对照组(Con组,n=24)、假手术组(Sham组,n=24)、骨癌痛模型组(Ca组,n=60),3组分别于手术前2 d、术后每隔4日测定机械痛阈(MWT)和热痛阈(TWL)。于术后7天确认造模成功后,将成功的模型鼠随机分为两组,即模型组(Ca组,n=28)和中药止痛贴组(CM组,n=25)。术后7 d,14 d和21 d各组处死大鼠(n≥8),取大鼠脊髓腰椎L4-6膨大处,用免疫组化方法测定脊髓背角p-ERK和p-p38的变化。结果脊髓背角神经pERK和p-p38表达:Ca组阳性神经元数目增加,术后7,14,21 d与Con组和Sham组比较有统计学差异(pp>0.05)。结论中药止痛贴对骨癌痛有比较明显的镇痛作用,其对脊髓背角c-fos的影响,可能是通过降低脊髓背角pERK和-p38的表达而产生的,即通过MApK-CREB信号转导通路完成的。

关键词：骨癌痛中药止痛贴 pERK p-p38 CREB

姜黄素降低Ⅲ型Cp/CppS模型鼠炎性反应因子的表达

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姜黄素降低Ⅲ型CP/CPPS模型鼠炎性反应因子的表达

作者：程邵龙重庆医科大学

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目的研究姜黄素对III型慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征(Cp/CppS)模型鼠炎性反应因子的影响。方法选取健康雄性SD大鼠40只,体重200～260 g,前列腺注射角叉菜胶建立Cp/CppS模型,将大鼠随机分为假手术组(sham)、Cp/CppS模型组(model)、... 详细信息

目的研究姜黄素对III型慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征(Cp/CppS)模型鼠炎性反应因子的影响。方法选取健康雄性SD大鼠40只,体重200～260 g,前列腺注射角叉菜胶建立Cp/CppS模型,将大鼠随机分为假手术组(sham)、Cp/CppS模型组(model)、姜黄素50及100 mg治疗组(cur-50 mg,cur-100 mg)和p38抑制剂组(SB203580),连续腹腔给药12d后,real-time pCR检测前列腺组织中TNF-α、p38、COX-2的mRNA表达;免疫组化检测TNF-α、COX-2的蛋白表达;Western blot检测p38、p-p38和NF-κB蛋白的表达。结果Cp/CppS模型组的NF-κB、p-p38、TNF-α和COX-2蛋白,TNF-α、COX-2和p38的mRNA表达较假手术组升高(pppp38与NF-κB的表达呈正相关(pp/CppS模型鼠NF-κB、TNF-α和COX-2及p-p38等炎性反应因子的表达;2)在该病中炎性反应因子p-p38可能参与了NF-κB的调控。

关键词： Cp/CppS p-p38 炎性反应因子姜黄素

长链非编码RNA LOC100911498在大鼠神经性疼痛中的调节作用

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长链非编码RNA LOC100911498在大鼠神经性疼痛中的调节作用

作者：汤文昕郑州大学

学位级别：硕士

研究背景神经病理性疼痛是一种导致患者生活质量严重下降的临床疼痛综合征,这可能是由躯体感觉神经系统功能障碍或原发性损伤造成的。但是,时至今日,神经病理性疼痛的发病机制仍未研究清楚,临床疗效不佳。长非编码RNA(lncRNA)是一种大于... 详细信息

研究背景神经病理性疼痛是一种导致患者生活质量严重下降的临床疼痛综合征,这可能是由躯体感觉神经系统功能障碍或原发性损伤造成的。但是,时至今日,神经病理性疼痛的发病机制仍未研究清楚,临床疗效不佳。长非编码RNA(lncRNA)是一种大于200个核苷酸的RNA分子,属于非编码蛋白,参与了细胞内多种过程的调控。近年研究发现,lncRNA的失调表达在促进神经病理性疼痛过程中起到了关键作用。以往的研究表明,在坐骨神经选择性损伤模型(SNI)中,大鼠脊髓背角的小胶质细胞发生增殖活化,p2X4受体(p2X4R)、磷酸化的蛋白激酶p38(p-p38)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达显著增加;此外,术后大鼠脊髓中lncRNA-LOC100911498的表达水平也明显提高。研究已经证实神经病理性疼痛能诱导p2X4R的表达增加,从而进一步促进p38磷酸化,p-p38可通过激活下游特定的转录因子使BDNF在小胶质细胞中的表达增加以致产生神经病理性的疼痛。LOC100911498是否与p2X4R相互作用参与了神经病理性疼痛的形成呢?我们使用了一种基于蛋白质的氨基酸和基因的碱基对序列、二级结构倾向、氢键和范德华力来预测和评估蛋白质和RNA之间的相互作用力的在线算法(CatRApID)评估了LOC100911498和p2X4R的相互作用力,其结果表明LOC100911498和p2X4R高度相关。因此,我们假设LOC100911498能通过激活p2X4R/p-p38/BDNF信号通路调控神经病理性疼痛的发生发展。研究目的本研究旨在讨论LOC100911498在神经病理性疼痛中的作用以及潜在机制。研究方法***100911498的表达在大鼠坐骨神经选择性损伤模型术后对疼痛行为学的影响以及在脊髓中的表达变化Sprague Dawley(SD)雄性大鼠分为sham组、SNI组、SNI+干扰RNA组(SNI+LOC100911498 siRNA组)和SNI+对照干扰RNA组(SNI+NC siRNA组),从术后第7天开始连续鞘内给药5天,从术前1天到术后1、3、5、7、9、11、14天测量大鼠后足底机械性缩足反射阈值(MWT),观察MWT的变化。并用原位杂交技术检测术后14天sham和SNI两组大鼠L4-6脊髓背角的表达差异。***100911498的表达对脊髓小胶质细胞活化及p2X4R-p-p38-BDNF信号通路的影响SD雄性大鼠分为sham组、SNI组、SNI+LOC100911498 siRNA组和SNI+NC siRNA组,采用RT-pCR技术检测术后第14天四组大鼠L4-6脊髓LOC100911498和p2X4R的表达变化;采用western blot检测脊髓中p2X4R、p38、p-p38和BDNF的分泌情况;采用免疫荧光双染技术观察大鼠脊髓背角中活化的小胶质细胞和p2X4R的表达差异。数据处理与分析用SpSS 10.0(SpSS Inc.,USA)和SigmaStat(Systat,San Jose,California)进行统计学测试。所有数据均表示为平均值±标准误差。对于MWT,通过双向(时间和处理)重复测量方差分析(ANOVA)分析数据,然后进行Newman-Keuls事后检验,并在相同时间点进行2组之间的t检验。单因素方差分析用于检测Western印迹、免疫荧光和实时pCR数据的统计学差异,然后进行Tukey或Dunnett检验,而原位杂交通过t检验进行测试,因为仅应用了2组。pp2X4R、p-p38和BDNF的表达水平显著增高,脊髓背角中活化的小胶质细胞的数量也较大,且这两组大鼠没有统计学差异。SNI+LOC100911498 siRNA组在术后给药后则能明显缩小上述差异,抑制小胶质细胞的活化和信号通路的激活。结论研究表明了lncRNA LOC100911498 siRNA对大鼠L4-6段脊髓背角小胶质细胞激活介导的p2X4R-p-p38-BDNF信号通路的影响。此外,通过调节p2X4R的表达和功能,LOC100911498可能是大鼠神经病理性疼痛的新型调

关键词：神经病理性疼痛坐骨神经选择性损伤 LOC100911498 小胶质细胞脊髓 p2X4受体 p-p38 BDNF

肝细胞性肝癌中Gadd45γ的表达及其抑制肝癌细胞生长的信号通路研究

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肝细胞性肝癌中Gadd45γ的表达及其抑制肝癌细胞生长的信号通路研...

作者：邵燕南京医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康。我国是原发性肝癌的高发国家，目前在我国的恶性肿瘤发病中居第二位。其中，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最主要的组织类型。探讨HCC组织中异常表达基因的分... 详细信息

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康。我国是原发性肝癌的高发国家，目前在我国的恶性肿瘤发病中居第二位。其中，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最主要的组织类型。探讨HCC组织中异常表达基因的分子生物学机制，对于了解其发生、发展过程以及诊断和治疗，有着重要的理论和实际意义。新近发现，Gadd45γ可以诱导人肝癌细胞HepG2发生G2／M期阻滞，但是具体的机制尚不清楚，故此，本研究就Gadd45γ在HCC组织中的表达及其抑制肝癌细胞生长的信号通路进行了初步探讨。第一部分肝癌组织中Gadd45γ的表达及紫外线诱导对人肝癌细胞中Gadd45γ的影响目的：观察HCC组织中Gadd45γ的蛋白表达水平及人肝癌细胞HepG2中Gadd45γ基因对紫外线的应激反应。方法：首先，选取临床HCC标本30例，运用免疫组织化学方法检测其中Gadd45γ蛋白表达水平;其次，在体外以人肝癌细胞HepG2为实验对象，给予UVB照射，分别在照射后1h、2h和4h收获细胞mRNA和总蛋白，同时设未给予UVB照射的细胞为对照组。运用RT-pCR和Western blot分别检测各组Gadd45γmRNA和蛋白表达水平。结果：(1)免疫组织化学染色显示，30例HCC癌组织中Gadd45γ的蛋白表达明显低于癌旁正常组织，其中17例出现了Gadd45γ表达缺失，缺失率约为57％。(2)经UVB照射后，Gadd45γmRNA和蛋白的表达均有明显上调，于照射后1h达到高峰(分别为0.91±0.24和0.55±0.14);此后Gadd45γmRNA和蛋白表达下降，至4h时，Gadd45γmRNA水平(0.4±0.05)与对照组(0.23±0.03)仍有差异，而蛋白表达(0.33±0.09)与对照组(0.34±0.12)相比已无统计学意义。结论：在肝细胞性肝癌组织中存在Gadd45γ蛋白水平异常下调;UVB可以迅速诱导人肝癌细胞HepG2中Gadd45γmRNA和蛋白的表达上调。第二部分Gadd45γ诱导人肝癌细胞G2／M期阻滞的相关信号转导通路研究目的：探讨Gadd45γ抑制肝癌细胞生长可能涉及的信号转导通路，为研究抑制肝癌细胞生长的基因提供初步理论依据。方法：体外培养人肝癌细胞HepG2，分别转染质粒pCMV-tag2B-Gadd45γ和pCMV-tag2B至细胞，采用western blot方法检测Gadd45γ及其下游基因p38、p-p38、JNK和p-JNK的表达变化;然后，给予信号通路的抑制剂(SB203580和Sp600125)分别特异性阻断p38和JNK的磷酸化，再运用流式细胞仪检测并比较各组细胞周期，进而分析Gadd45γ诱导肝癌细胞HepG2 G2／M期阻滞可能涉及的信号通路。结果：(1)将质粒pCMV-tag2B-Gadd45γ转染至人肝癌细胞HepG2 48h后，Gadd45γ蛋白表达至峰值为0.48±0.04，其下游的p38和JNK磷酸化水平也都明显提高。(2)运用特异性抑制剂使p38和JNK的磷酸化表达降低，达到对照组磷酸化水平，但细胞仍表现为G2／M阻滞，阻滞程度较非抑制剂组明显减弱。结论：在HepG2细胞中高表达Gadd45γ蛋白可以激活Gadd45γ-p38和Gadd45γ-JNK信号转导通路;Gadd45γ-p38和Gadd45γ-JNK通路参与了Gadd45γ诱导的肝癌细胞G2／M期阻滞。

关键词： Gadd45γ HCC UVB HepG2 Gadd45γ HepG2 G2/M p38 p-p38 JNK p-JNK

化合物Baicalein通过限制性激活EGFR发挥抗肿瘤作用

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化合物Baicalein通过限制性激活EGFR发挥抗肿瘤作用

作者：孙学頔厦门大学

学位级别：硕士

皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是起源于表皮或者附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤,约占所有皮肤恶性肿瘤的20%。近年来由于长期暴露在紫外线以及人们生活习惯的改变,发病率逐年攀升。虽然在发病初期,皮肤鳞状细胞癌的恶性程度较低,转移性较弱,... 详细信息

皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是起源于表皮或者附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤,约占所有皮肤恶性肿瘤的20%。近年来由于长期暴露在紫外线以及人们生活习惯的改变,发病率逐年攀升。虽然在发病初期,皮肤鳞状细胞癌的恶性程度较低,转移性较弱,大部分均可以通过手术切除,但仍然会有少数会发展为晚期。晚期的皮肤鳞状细胞癌转移性大大增加,预后极差,且伴有出血和感染等并发症。目前临床上对晚期皮肤鳞状细胞癌缺乏有效的治疗手段。化合物Baicalein中文名为黄芩素,是从中药黄芩根中提取出来的黄酮类物质。之前有研究表明化合物Baicalein可以明显抑制TpA所诱导的皮肤癌的发生和发展。但其作用机制尚不明确。在原发性肿瘤中,过度表达的表皮生长因子受体EGFR在皮肤鳞状细胞癌的淋巴结转移和细胞增殖中发挥着重要作用。EGFR已经成为治疗皮肤鳞状细胞癌的有效靶点。本研究利用皮肤鳞状细胞癌细胞系A431,深入探究了化合物Baicalein的抑癌机制。我们研究发现化合物Baicalein可以通过激活EGFR选择性激活下游信号p-p38和p-JNK,诱导肿瘤细胞产生空泡,促进肿瘤细胞自噬,抑制肿瘤细胞生存。此过程具有时间和浓度依赖性。EGF与其共加,更是加快了肿瘤细胞死亡的发生。而EGFR小分子抑制剂化合物Erlotinib可以抑制该过程。化合物Baicalein还可以将细胞周期阻滞在G0/G1期,引起肿瘤细胞发生凋亡。而周期阻滞以及凋亡均可能与EGFR的激活没有关系。因此,化合物Baicalein促进肿瘤细胞自噬所诱导的细胞死亡是凋亡非依赖的。此外我们还发现化合物Baicalein也可以诱导肿瘤细胞分化,抑制肿瘤细胞EMT和侵袭过程。本研究从多方面探究了化合物Baicalein对皮肤鳞状细胞癌的抑制作用,进一步阐明了其抑制皮肤鳞状细胞癌的部分机制。化合物Baicalein已经成为治疗皮肤鳞状细胞癌的潜在化合物。本次研究更是推动了其治疗皮肤鳞状细胞癌的成药进程。另外,化合物Baicalein抑癌机制的探究也为肿瘤治疗提供了一个新思路。

关键词：皮肤鳞状细胞癌化合物Baicalein EGFR p-p38 p-JNK

肿瘤微环境酸化通过ASICs促进MDSCs免疫抑制功能及其机制的研究

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肿瘤微环境酸化通过ASICs促进MDSCs免疫抑制功能及其机制的研究

作者：伊萍中南民族大学

学位级别：硕士

髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressors cells,MDSCs)是诱导肿瘤酸化微环境免疫抑制状态的重要细胞,往往导致肿瘤免疫治疗的失败。酸敏感离子通道(ASICs)是由H激活的门控阳离子通道,可以感知细胞内外H梯度的变化。本课题以小鼠来源... 详细信息

髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressors cells,MDSCs)是诱导肿瘤酸化微环境免疫抑制状态的重要细胞,往往导致肿瘤免疫治疗的失败。酸敏感离子通道(ASICs)是由H激活的门控阳离子通道,可以感知细胞内外H梯度的变化。本课题以小鼠来源的MDSCs为研究对象,探讨肿瘤酸化微环境促进MDSCs活化是否与其表达ASICs有关,以及ASICs对MDSCs的功能影响机制,主要研究内容和结果如下:1.肿瘤微环境酸化对MDSCs功能的影响肿瘤微环境酸化可促进MDSCs分泌抑制性的细胞因子。当pH降低至5.5较正常来源对照,酸化环境明显促进MDSCs表达ROS,COX-2,TNF-?,ARG-1。预先用阿米洛利处理可以明显抑制酸化环境刺激MDSCs因子分泌,预先用ASIC1抑制剂pcTx1能够抑制荷瘤小鼠MDSCs TNF-α表达,ASIC3抑制剂ApET×2明显降低COX-2分泌,且两者均能减少ROS和ARG-1的产生。进一步研究发现预先加入pcTx1或ApET×2均能够逆转MDSCs对T细胞增殖的抑制作用,使T细胞增殖显著增加恢复到正常增殖水平。上述结果提示ASIC1和ASIC3在酸化环境刺激MDSCs活化过程中起到重要作用。2.肿瘤微环境酸化对MDSCs功能影响的分子机制2.1微环境酸化时荷瘤小鼠来源MDSCs p38磷酸化水平明显增高,且预先加入阿米洛利后,p38磷酸化水平显著降低,酸化环境能够刺激MDSCs NF-кB途径的p65活化,分别用阿米洛利、pcTx1、ApET×2预处理,发现pcTx1能够抑制p-p65,p-IкB,pIKK磷酸化,即抑制NF-кB信号通路活化,而ApET×2对该信号通路作用不明显,提示MDSCs在酸化环境中NF-кB途径被激活,且其激活过程与ASIC1密切相关。2.2微环境酸化时,荷瘤小鼠MDSCs STAT1,STAT6磷酸化水平增高,预先加入阿米洛利、pcTx1、ApET×2,发现pSTAT1,pSTAT6磷酸化水平显著下降,提示酸化条件可能通过刺激ASIC1,ASIC3,促发转录因子STAT1,STAT6磷酸化活化,进而介导MDSCs活化发挥免疫抑制作用。结论:(1)肿瘤酸化微环境促进MDSCs分泌ROS,COX2,TNF-α细胞因子,且pcTx1能够抑制荷瘤小鼠MDSCs TNF-α表达,ApET×2明显降低COX2分泌,且两者均能减少ROS和ARG-1的产生。同时,pcTx1,ApET×2能够逆转MDSCs对T细胞增殖的抑制作用。(2)在酸化环境中NF-кB途径被激活,且其激活过程与ASIC1密切相关。同时,酸化条件可能通过刺激ASIC1,ASIC3,促发转录因子STAT1,STAT6磷酸化活化,进而介导MDSCs活化发挥免疫抑制作用。

关键词：髓系来源细胞酸敏感离子通道 ROS p-p38 p-p65 p-STAT1 pSTAT6

UCH-L1在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌转移关系的研究

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UCH-L1在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌转移关系的研究

作者：陈晓玲中国医科大学

学位级别：硕士

前言泛素羧基末端水解酶L1 (UCH-L1),又叫蛋白基因产物9.5(pGp9.5),属于泛素羧基末端水解酶家族,参与泛素介导的蛋白质降解途径,其主要作用是当泛素化的底物附着到蛋白酶体后,UCH-L1水解泛素和底物蛋白质间的链,然后底物进入蛋白酶体被... 详细信息

前言泛素羧基末端水解酶L1 (UCH-L1),又叫蛋白基因产物9.5(pGp9.5),属于泛素羧基末端水解酶家族,参与泛素介导的蛋白质降解途径,其主要作用是当泛素化的底物附着到蛋白酶体后,UCH-L1水解泛素和底物蛋白质间的链,然后底物进入蛋白酶体被降解,而多聚泛素被切割为单体重新参与泛素蛋白酶体的循环,具有泛素连接酶活性及泛素水解酶活性。早期关于UCH-L1的研究集中于它对神经组织以及性别发育的作用,尤其在帕金森病的研究中较多。近年研究表明,UCH-L1的表达有严格的时间和空间特异性,异常表达常常与细胞的恶性转化和肿瘤的发生有关。UCH-L1在多种肿瘤中高表达,在部分肿瘤中其表达与肿瘤浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MApK)是细胞内的主要信息传递系统。p38是MApK家族重要成员之一。它是一种广泛存在于细胞质中的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,可将细胞外信息传递至细胞核中,从而介导细胞产生各种反应。p38通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,调控活性物质的表达。p38MApK信号通路参与肿瘤的侵袭和转移以及肿瘤细胞生长和增殖。经研究发现,UCH-L1与p38存在一定关系。非小细胞肺癌中用RNA干扰抑制UCH-L1的表达,能够抑制非小细胞肺癌体内外的转移,抑制p38的激活。在乳腺癌中UCH-L1的表达是否与肿瘤的分化程度以及侵袭转移有关,UCH-L1与p38之间调控关系如何,目前报道较少。材料和方法一、材料(一)临床资料收集80例乳腺癌组织,取自于中国医科大学附属第一医院2002年1月至2008年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。80例乳腺癌组织均为乳腺浸润性导管癌(IDC),按TNM分期标准,Ⅰ-Ⅱ期48例,Ⅲ-Ⅳ期32例。有淋巴结转移33例,无淋巴结转移47例。收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为IDC,(有淋巴结转移14例),20例为乳腺纤维腺瘤。(二)细胞系一种乳腺正常上皮细胞系MCF-10A和两种乳腺癌细胞系(MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系、MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系)原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由已有的细胞复苏而得。(三)主要试剂鼠抗人UCH-L1单克隆抗体(sc-58593)购自SANTA CRUZ公司,鼠抗人p-p38单克隆抗体(#9216)购自Cell signaling公司。UCH-L1抑制剂(#662086)购自Merck公司。Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。二、方法(一)免疫组织化学技术80例标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-peroxidase, S-p)按说明书行免疫组化染色。UCH-L1稀释比例为1：150,p-p38稀释比例为1：200,以pBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。(二)Western blot技术总蛋白从组织、生长到对数期收集的细胞及不同浓度的UCH-L1抑制剂处理24小时后的MDA-MB-435s细胞中提取。用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白,进行SDS-pAGE和转印,分别孵育一抗(UCH-L11:400, p-p381:400稀释)4℃过夜,相应二抗(1：4000)37℃孵育,ECL发光,拍照。用表达阳性的pVDF膜剥脱后重新孵育β-actin抗体作为内参。(三)Transwell实验上室加入1:6Matrigel胶制成的人工基底膜后接种总体积200ul的MDA-MB-435s细胞,并加入终浓度分别为0umol、5umol、10umol、20umol的UCH-L1抑制剂。每个药物浓度做3复孔,37℃培养24h后观察。擦掉基底膜上室面的细胞,下室细胞固定后Giemsa染色。400×光镜下随机选择30个视野计数,取其平均数为穿膜细胞数。三、统计学分析应用SpSS 16.0统计软件行数据处理：采用x2检验(不满条件时用Fisher确切概率法)分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析UCH-L1蛋白与p-p38蛋白表达的关系,采用t检验分析Western Blot图像灰度值,transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,p<0.05为差异有统计学意义。结果一、UCH-

关键词： UCH-L1 p-p38 乳腺癌转移

美洲大蠊提取物对高转移性卵巢癌细胞株HO-8910pM的作用研究

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美洲大蠊提取物对高转移性卵巢癌细胞株HO-8910PM的作用研究

作者：齐奇锦州医科大学

学位级别：硕士

目的探讨美洲大蠊提取物对人高转移性卵巢癌细胞株HO-8910pM增殖、凋亡、迁移、成血管的作用及作用机制,为其临床辅助治疗卵巢癌提供理论指导。方法1、实验分组:美洲大蠊提取物(10、20、30、40mg/L)组和空白组(未加药)。2、采用MTT法测... 详细信息

目的探讨美洲大蠊提取物对人高转移性卵巢癌细胞株HO-8910pM增殖、凋亡、迁移、成血管的作用及作用机制,为其临床辅助治疗卵巢癌提供理论指导。方法1、实验分组:美洲大蠊提取物(10、20、30、40mg/L)组和空白组(未加药)。2、采用MTT法测量不同浓度美洲大蠊提取物对HO-8910pM生长增殖的影响。3、Western blot法检测不同浓度美洲大蠊提取物处理HO-8910pM内AKT、p-AKT、p38、p-p38和ERK1/2、p-ERK1/2及VEGF蛋白的表达,以此推论各组细胞凋亡与pI3K-AKT、Ras/Raf/MEK/ERK和p38 MApK信号通路的关系及美洲大蠊对HO-8910pM成血管作用的影响。4、利用JC-1染色在荧光显微镜下观察不同浓度美洲大蠊提取物下HO-8910pM细胞的线粒体膜电位变化情况。5、通过Annexin V-FITC双染法经流式细胞仪定量检测不同质量浓度的美洲大蠊提取物对HO-8910pM细胞增殖与凋亡的影响,并测得各组细胞凋亡率。6、细胞划痕实验检测美洲大蠊提取物对细胞迁移作用的影响。结果1、MTT法:作用时间相同时,美洲大蠊提取物可以抑制HO-8910pM的增殖并随药物质量浓度升高其生长抑制率也升高,并计算其IC50为(22.08±1.5)mg/L。2、Western blot:随着美洲大蠊提取物浓度升高,细胞内AKT、ERK1/2、p38磷酸化水平逐渐降低,且AKT、p38和ERK1/2蛋白水平则无明显变化;随着美洲大蠊提取物浓度升高VEGF蛋白表达水平逐步下降。3、JC-1染色:与空白组比较,美洲大蠊药物组细胞的线粒体膜电位下降更显著。4、流式细胞术:空白组及(10、20、30)mg/L药物组的细胞凋亡率分别为(15.1±0.21)、(15.5±0.47)、(20.3±0.89)、(27.1±0.70),此作用呈浓度依赖性,当美洲大蠊浓度低于30mg/L时随pA浓度升高其凋亡率也逐步上升。5、细胞划痕实验:美洲大蠊药物组的细胞增殖能力显著下降,并随着浓度增加甚至出现大面积凋亡的现象。结论美洲大蠊提取物能抑制卵巢癌高转移细胞株HO-8910pM的增殖、促进其凋亡、抑制其迁徙、成血管作用,促凋亡机制可能与通过降低AKT、ERK1/2、p38蛋白磷酸化水平有关。

关键词：美洲大蠊提取物 HO-8910pM细胞株 p-AKT p-ERK1/2 p-p38 VEGF

猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

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猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

作者：刘敏扬州大学

学位级别：硕士

食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食... 详细信息

食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食、睡眠与觉醒、能量代谢和神经内分泌稳态等活动。然而目前,关于食欲肽及食欲肽受体的研究主要集中在人上,关于猪OX2R(pOX2R)以及其突变型的生理活性的研究较少。为了更进一步的研究pOX2R的生理功能,了解配体作用受体后胞内的信号转导特性,进而为育种优化等提供依据,本研究以实验室已构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT质粒为模板,根据已有文献中基因多态性与信号转导的关系选择了 p10S、p11T、V3081和T401I四个突变体;利用单点突变技术成功构建四个突变体的真核表达载体,再将pOX2R突变体真核表达载体与野生型(Wild type,WT)真核表达载体分别转染入HEK293T细胞中,Western blot技术验证其是否能在体外细胞中正常表达;利用双报告基因法检测WT与突变体在不同浓度配体刺激下胞内总环磷酸酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMp)白的表达水平;利用Western blot的方法评价高浓度激动剂下对WT与突变体下游磷酸化细胞外调节蛋白激酶 1/2(phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、磷酸化p38和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated cAMp-response element bindingprotein,p-CREB)的表达的影响,以此研究pOX2R的生理功能。主要研究结果如下:1、以构建好的pOX2R WT真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT为模板,利用定点突变技术成功构建四个突变体。将构建好的四种突变体分别命名为pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-p10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-p11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I 和pcDN A3.1(+)-myc/pOX2 R-T401I。2、将构建好的突变体与WT质粒分别转染入HEK293T细胞中,转染后24 h提取细胞总蛋白,利用Western blot技术验证其在细胞中的表达。结果显示,pOX2R的WT与四个突变体在细胞中均能够顺利表达。3、将pOX2R WT与四个突变体真核表达载体分别与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK按照2:10:1的比例共转染入HEK293T细胞中,检测细胞内基础cAMp水平。结果显示四个突变体的胞内基础cAMp水平与WT相比无显著差异。采用不同浓度(10-6M-10-10M)的OXA和OXB分别对表达WT和四个突变体pOX2R的细胞进行刺激。研究结果表明,不管是pOX2R WT还是突变体,胞内的cAMp水平呈现明显的剂量效应关系。相比于WT,突变体p10S、p11T和T401I对相同浓度激动剂OXA的响应显著下降。在相同浓度激动剂OXB刺激下,只有突变体p11T与WT相比灵敏度显著降低。上述结果表明,第10、11和401位氨基酸的突变均能对胞内的pKA通路产生影响。4、将pOX2R WT与突变体分别瞬时转染入HEK293T细胞中,10-6 M OXB和10-7 M OXA分别进行刺激,提取总蛋白,利用Westernblot技术检测p-ERK1/2、p-p38和p-CREB的蛋白表达水平。结果表明,在OXA和OXB诱导下,四个突变体胞内p-CREB表达水平与WT相比均显著下降;与WT相比,在OXA的刺激下,突变体V3081的p-ERK1/2显著降低,突变体p10S、p11T和V308I的p38磷酸化水平显著降低;在配体OXB诱导下,突变体T401I胞内p-ERK/2水平显著降低,突变体p11T的p-p38水平显著降低。上述结果表明,这四个位点的突变能对pKC及MApK通路产生影响。

关键词：猪食欲肽受体2 突变体 cAMp p-ERK/2 p-p38 p-CREB