猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

作     者：刘敏 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王志强

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：猪 食欲肽受体2 突变体 cAMP p-ERK/2 p-p38 p-CREB 

摘      要：食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食、睡眠与觉醒、能量代谢和神经内分泌稳态等活动。然而目前,关于食欲肽及食欲肽受体的研究主要集中在人上,关于猪OX2R(pOX2R)以及其突变型的生理活性的研究较少。为了更进一步的研究pOX2R的生理功能,了解配体作用受体后胞内的信号转导特性,进而为育种优化等提供依据,本研究以实验室已构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT质粒为模板,根据已有文献中基因多态性与信号转导的关系选择了 P10S、P11T、V3081和T401I四个突变体;利用单点突变技术成功构建四个突变体的真核表达载体,再将pOX2R突变体真核表达载体与野生型(Wild type,WT)真核表达载体分别转染入HEK293T细胞中,Western blot技术验证其是否能在体外细胞中正常表达;利用双报告基因法检测WT与突变体在不同浓度配体刺激下胞内总环磷酸酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)白的表达水平;利用Western blot的方法评价高浓度激动剂下对WT与突变体下游磷酸化细胞外调节蛋白激酶 1/2(Phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、磷酸化p38和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(Phosphorylated cAMP-response element bindingprotein,p-CREB)的表达的影响,以此研究pOX2R的生理功能。主要研究结果如下:1、以构建好的pOX2R WT真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT为模板,利用定点突变技术成功构建四个突变体。将构建好的四种突变体分别命名为pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I 和pcDN A3.1(+)-myc/pOX2 R-T401I。2、将构建好的突变体与WT质粒分别转染入HEK293T细胞中,转染后24 h提取细胞总蛋白,利用Western blot技术验证其在细胞中的表达。结果显示,pOX2R的WT与四个突变体在细胞中均能够顺利表达。3、将pOX2R WT与四个突变体真核表达载体分别与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK按照2:10:1的比例共转染入HEK293T细胞中,检测细胞内基础cAMP水平。结果显示四个突变体的胞内基础cAMP水平与WT相比无显著差异。采用不同浓度(10-6M-10-10M)的OXA和OXB分别对表达WT和四个突变体pOX2R的细胞进行刺激。研究结果表明,不管是pOX2R WT还是突变体,胞内的cAMP水平呈现明显的剂量效应关系。相比于WT,突变体P10S、P11T和T401I对相同浓度激动剂OXA的响应显著下降。在相同浓度激动剂OXB刺激下,只有突变体P11T与WT相比灵敏度显著降低。上述结果表明,第10、11和401位氨基酸的突变均能对胞内的PKA通路产生影响。4、将pOX2R WT与突变体分别瞬时转染入HEK293T细胞中,10-6 M OXB和10-7 M OXA分别进行刺激,提取总蛋白,利用Westernblot技术检测p-ERK1/2、p-p38和p-CREB的蛋白表达水平。结果表明,在OXA和OXB诱导下,四个突变体胞内p-CREB表达水平与WT相比均显著下降;与WT相比,在OXA的刺激下,突变体V3081的p-ERK1/2显著降低,突变体P10S、P11T和V308I的p38磷酸化水平显著降低;在配体OXB诱导下,突变体T401I胞内p-ERK/2水平显著降低,突变体P11T的p-p38水平显著降低。上述结果表明,这四个位点的突变能对PKC及MAPK通路产生影响。