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畜牧与兽医 2014年第8期46卷 18-21页

作者：蔺帅石琳周东庆孙艳君王志强扬州大学兽医学院江苏扬州225009

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.... 详细信息

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。

关键词：猪食欲肽受体2 真核表达

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猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

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作者：刘敏扬州大学

学位级别：硕士

食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食... 详细信息

食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食、睡眠与觉醒、能量代谢和神经内分泌稳态等活动。然而目前,关于食欲肽及食欲肽受体的研究主要集中在人上,关于猪OX2R(pOX2R)以及其突变型的生理活性的研究较少。为了更进一步的研究pOX2R的生理功能,了解配体作用受体后胞内的信号转导特性,进而为育种优化等提供依据,本研究以实验室已构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT质粒为模板,根据已有文献中基因多态性与信号转导的关系选择了 P10S、P11T、V3081和T401I四个突变体;利用单点突变技术成功构建四个突变体的真核表达载体,再将pOX2R突变体真核表达载体与野生型(Wild type,WT)真核表达载体分别转染入HEK293T细胞中,Western blot技术验证其是否能在体外细胞中正常表达;利用双报告基因法检测WT与突变体在不同浓度配体刺激下胞内总环磷酸酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)白的表达水平;利用Western blot的方法评价高浓度激动剂下对WT与突变体下游磷酸化细胞外调节蛋白激酶 1/2(Phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、磷酸化p38和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(Phosphorylated cAMP-response element bindingprotein,p-CREB)的表达的影响,以此研究pOX2R的生理功能。主要研究结果如下:1、以构建好的pOX2R WT真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT为模板,利用定点突变技术成功构建四个突变体。将构建好的四种突变体分别命名为pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I 和pcDN A3.1(+)-myc/pOX2 R-T401I。2、将构建好的突变体与WT质粒分别转染入HEK293T细胞中,转染后24 h提取细胞总蛋白,利用Western blot技术验证其在细胞中的表达。结果显示,pOX2R的WT与四个突变体在细胞中均能够顺利表达。3、将pOX2R WT与四个突变体真核表达载体分别与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK按照2:10:1的比例共转染入HEK293T细胞中,检测细胞内基础cAMP水平。结果显示四个突变体的胞内基础cAMP水平与WT相比无显著差异。采用不同浓度(10-6M-10-10M)的OXA和OXB分别对表达WT和四个突变体pOX2R的细胞进行刺激。研究结果表明,不管是pOX2R WT还是突变体,胞内的cAMP水平呈现明显的剂量效应关系。相比于WT,突变体P10S、P11T和T401I对相同浓度激动剂OXA的响应显著下降。在相同浓度激动剂OXB刺激下,只有突变体P11T与WT相比灵敏度显著降低。上述结果表明,第10、11和401位氨基酸的突变均能对胞内的PKA通路产生影响。4、将pOX2R WT与突变体分别瞬时转染入HEK293T细胞中,10-6 M OXB和10-7 M OXA分别进行刺激,提取总蛋白,利用Westernblot技术检测p-ERK1/2、p-p38和p-CREB的蛋白表达水平。结果表明,在OXA和OXB诱导下,四个突变体胞内p-CREB表达水平与WT相比均显著下降;与WT相比,在OXA的刺激下,突变体V3081的p-ERK1/2显著降低,突变体P10S、P11T和V308I的p38磷酸化水平显著降低;在配体OXB诱导下,突变体T401I胞内p-ERK/2水平显著降低,突变体P11T的p-p38水平显著降低。上述结果表明,这四个位点的突变能对PKC及MAPK通路产生影响。

关键词：猪食欲肽受体2 突变体 cAMP p-ERK/2 p-p38 p-CREB

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猪OX2R基因分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响

猪OX2R基因分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响

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作者：蔺帅扬州大学

学位级别：硕士

食欲肽(Orexin)是一个能够在大脑不同区域高效表达的重要神经肽,而且是一个能调节能量动态平衡的重要信号分子,食欲肽是通过相应受体即食欲肽受体(OX1R和OX2R)发挥作用的,其被发现与动物的摄食、体重、醒觉循环、能量平衡、神经功能、... 详细信息

食欲肽(Orexin)是一个能够在大脑不同区域高效表达的重要神经肽,而且是一个能调节能量动态平衡的重要信号分子,食欲肽是通过相应受体即食欲肽受体(OX1R和OX2R)发挥作用的,其被发现与动物的摄食、体重、醒觉循环、能量平衡、神经功能、心血管功能调节和疼痛有关。信号分子与细胞表面的食欲肽受体2结合,即可以通过Gq蛋白介导,激活磷脂酶Cβ (PLCp),以三磷酸肌醇(IP3)为第二信使的信号通路,又能够通过Gs或Gi蛋白介导,激活腺苷酸环化酶(AC),以环磷酸腺苷(cAMP)为第二信使的信号通路。为了揭示OX2R在猪的生长及能量调控中所起的作用,本研究通过对猪OX2R基因进行分子克隆以及真核表达载体的构建,获得pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R重组质粒后,与3×PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]质粒共转染HEK293T细胞,用不同配体作用于细胞后,然后用微孔板检测仪检测荧光素酶的表达量。主要研究结果如下：1、采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增到大小为1332bp的OX2R目的基因。将猪OX2R基因片段连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体并获重组质粒pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R.2、将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R质粒以脂质体法转染HEK293T细胞,用Western blot检测OX2R在HEK293T细胞的表达,结果显示猪OX2R蛋白成功表达。3、将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R质粒和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]报告基因质粒按1：5的比例共转染HEK293T细胞。10-4M(高)、10-7M(中)和10-10M(低)三个不同浓度的TCS分别与一系列不同浓度的激动剂食欲肽A或食欲肽B作用于共同表达OX2R和荧光素酶的HEK293T细胞,通过检测荧光素酶的表达数量,间接评估各配体与受体结合后对细胞内cAMP信号通路的影响。结果发现,配体在一定浓度的范围内,细胞内cAMP水平与各配体的浓度呈良好的剂量效应关系。

关键词：猪食欲肽受体2 环磷酸腺苷报告基因

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