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利用gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

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分子植物育种 2004年第3期2卷 358-364页

作者：梅文倩宋文强潘怡巩威朱玉贤北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京100871

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体... 详细信息

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和West-ern-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。

关键词： gateway克隆技术拟南芥转录因子聚类分析功能基因组

转录因子DREB1A基因的克隆与gateway克隆技术构建植物表达载体

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生物技术通讯 2007年第2期18卷 205-208页

作者：佟友丽赵飞冯君伟李玉花东北林业大学花卉生物工程研究所黑龙江哈尔滨150040

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据gateway克隆技术的要求... 详细信息

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。

关键词：转录因子DREB1A gateway克隆技术植物表达载体

使用与gateway技术兼容的T载体获得入门克隆

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生物化学与生物物理进展 2004年第10期31卷 951-954页

作者：陈其军安瑞周海梦陈珈王学臣中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室北京100094 清华大学生物科学与技术系北京100084

与gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与... 详细信息

与gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与gateway重组克隆技术进行整合 ,构建了与gateway技术兼容的两种TA克隆载体 ,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆 .利用兼容gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题 .

关键词： gateway克隆技术 TA克隆技术入门载体 T载体入门克隆

小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在gateway技术上的可诱导表达载体的构建

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华北农学报 2011年第2期26卷 17-22页

作者：李明丁博牛有雄吕芳芳杨文丽 Silin Zhong 孙守钧谢晓东天津农学院农学系天津300384 Boyce Thompson Institute for Plant Research Cornell University NY14853 USA

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守... 详细信息

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。

关键词：小麦 WRKY转录因子 gateway克隆技术可诱导表达载体

花椰菜ERF114基因的克隆及gateway技术构建表达载体

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西南农业学报 2018年第6期31卷 1128-1134页

作者：韩占品任健于玮玮范夕玲李慧天津农学院园艺园林学院天津300384 天津农学院基础科学学院天津300384

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用gateway技术构建ERF114基因的植物... 详细信息

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。

关键词：花椰菜 ERF114 AP2/ERF gateway克隆技术生物信息学

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速gateway克隆系统（英文）

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中国生物化学与分子生物学报 2018年第3期34卷 341-350页

作者：朱晓博张贵粉王友梅 Staffan Persson 谢国生王令强华中农业大学生物质与生物能源研究中心武汉430070 华中农业大学植物科学与技术学院武汉430070 墨尔本大学生物科学学院细胞壁研究中心澳大利亚墨尔本VIC3010

gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵... 详细信息

gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点"core attL"的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入p MD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到p MD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。

关键词： gateway克隆技术直接LR反应序列比对特异位点

神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP的构建及鉴定

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中国老年学杂志 2011年第6期31卷 1002-1006页

作者：张正达周盛年刘黎青刘丽霞山东大学齐鲁医院神经内科山东济南250012 山东中医药大学组织胚胎学教研室

目的探讨构建具有神经细胞表达特异性的TUBA1α-EGFP真核表达载体,为进一步研究神经元细胞的发生与转化奠定基础。方法采用PCR技术克隆出长分别为1.121 kb与0.72 kb的TUBA1α启动子及EGFP基因部分序列,利用gateway克隆技术构建***2 ***-... 详细信息

目的探讨构建具有神经细胞表达特异性的TUBA1α-EGFP真核表达载体,为进一步研究神经元细胞的发生与转化奠定基础。方法采用PCR技术克隆出长分别为1.121 kb与0.72 kb的TUBA1α启动子及EGFP基因部分序列,利用gateway克隆技术构建***2 ***-TU-BA1α>EGFP质粒。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,所克隆的1.121 kb与0.72 kb的TU-BA1α启动子及EGFP基因片段成功地连接到***2 ***载体上,DNA测序证实插入到载体中的片段为目的片段。结论成功构建了神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP。

关键词：微管蛋白1α 增强型绿荧光蛋白 gateway克隆技术

乳酸杆菌组成型启动子探测载体pgateway-612的构建

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 849-853页

作者：陈家锃崔红玉田志军葛俊伟安同庆彭金美李一经东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为筛选适宜乳酸菌(LAB)宿主表达载体的启动子,本研究以大肠杆菌-LAB穿梭载体pPG612为基本骨架,利用gatewayTM克隆技术操作构建了LAB组成型启动子探测载体,并利用该载体筛选了短乳杆菌的S层启动子。我们利用底物X-gluC与报告基因gusA编... 详细信息

为筛选适宜乳酸菌(LAB)宿主表达载体的启动子,本研究以大肠杆菌-LAB穿梭载体pPG612为基本骨架,利用gatewayTM克隆技术操作构建了LAB组成型启动子探测载体,并利用该载体筛选了短乳杆菌的S层启动子。我们利用底物X-gluC与报告基因gusA编码的蛋白酶之间的特异性显色反应筛选阳性菌落,超声破碎后的菌体蛋白经SDS-PAGE和western blot分析表明该启动子在宿主菌中具有组成型启动子活性。本研究为进一步利用表达载体及筛选其他LAB启动子奠定基础。

关键词：乳酸菌启动子探测载体 gateway克隆技术 X-gluC

津田芜菁隐花色素CRY1 RNA干涉载体的构建

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分子植物育种 2013年第3期11卷 437-442页

作者：孙梅周波马光刘明雪李玉花东北林业大学花卉生物工程研究所哈尔滨150040

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异... 详细信息

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。

关键词：芜菁 CRY1 gateway克隆技术 RNA干涉