利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

作     者：马宁 董晓燕 姜艳芳 刘蒙蒙 刘子玲 MA Ning;DONG Xiao-yan;JIANG Yan-fang;LIU Meng-meng;LIU Zi-ling

作者机构：吉林大学第一医院血液肿瘤科吉林长春130021 吉林大学第一医院风湿免疫科吉林长春130021 河南省人民医院血液病研究所河南郑州450000 吉林大学第一医院二部中心研究室吉林长春130031 

出 版 物：《吉林大学学报（医学版）》 (Journal of Jilin University：Medicine Edition)

年 卷 期：2014年第40卷第4期

页      面：898-903,I0004页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：吉林省科技厅科研基金资助课题(200705181) 

主　　题：Hiwi基因 腺病毒 重叠延伸聚合酶链反应 Gateway克隆技术 

摘      要：目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES-hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体***1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体***1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果:人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论:成功构建重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。