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实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织中PTCH-1和smo基因的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第10期26卷 955-958页

作者：肖白玉党华甘嘉裕蔡谦张国萍常弘中山大学生命科学学院广东广州510275 中山大学附属第一医院黄埔院区广东广州510700 附属第二医院广东广州510120

目的:检测Hedgehog信号通路基因PTCH-1和smo在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及其生物学意义。方法:利用实时荧光定量PCR分别检测32例鼻咽癌组织及32例鼻咽炎组织中PTCH-1和smo基因的表达情况。根据Livak(2-△△Ct)法进行相对定量表达分析,以... 详细信息

目的:检测Hedgehog信号通路基因PTCH-1和smo在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及其生物学意义。方法:利用实时荧光定量PCR分别检测32例鼻咽癌组织及32例鼻咽炎组织中PTCH-1和smo基因的表达情况。根据Livak(2-△△Ct)法进行相对定量表达分析,以鼻咽炎组织为对照,计算鼻咽癌组织中PTCH-1和smo表达水平。结果:在所检测的全部鼻咽癌组织和鼻咽炎组织中PTCH-1和smo都有表达。与鼻咽炎组织相比,有75%(24/32)鼻咽癌组织的PTCH-1基因表达水平下调,有68.8%(22/32)鼻咽癌组织的smo表达水平上调,差异均具有统计学意义(P基因表达水平上调,有15.6%(5/32)鼻咽癌组织smo基因表达水平下调,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:在鼻咽癌中smo基因普遍具有较高的表达水平,PTCH-1基因的表达水平则相对较低,而smo基因表达水平的上调及PTCH-1基因表达水平的下调,可引起Hedgehog信号通路在鼻咽癌中的异常激活,Hedgehog信号通路的异常激活可能与鼻咽癌的发生发展过程相关。

关键词：鼻咽癌 PTCH-1基因 smo基因实时荧光定量PCR

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牙源性角化囊肿smo基因突变检测

中华口腔医学杂志 2022年第2期57卷 149-153页

作者：翟洁梅王珊洪瑛瑛曲佳菲杨春李铁军北京大学口腔医学院·口腔医院病理科国家口腔医学中心国家口腔疾病临床医学研究中心口腔生物材料和数字诊疗装备国家工程研究中心口腔数字医学北京市重点实验室北京100081 昆明医科大学口腔医学院口腔基础医学教研室昆明650500 北京大学口腔医学院·口腔医院门诊部国家口腔医学中心国家口腔疾病临床医学研究中心口腔生物材料和数字诊疗装备国家工程研究中心口腔数字医学北京市重点实验室北京100081 天津市口腔医院国际诊疗中心天津市口腔功能重建重点实验室天津300041

目的检测牙源性角化囊肿(odontogenic keratocyst,OKC)是否存在smo基因突变,进一步完善对OKC发病机制的认识。方法收集2012年9月至2017年6月就诊于北京大学口腔医学院·口腔医院口腔颌面外科的OKC患者,10例为痣样基底细胞癌综合征性OKC... 详细信息

目的检测牙源性角化囊肿(odontogenic keratocyst,OKC)是否存在smo基因突变,进一步完善对OKC发病机制的认识。方法收集2012年9月至2017年6月就诊于北京大学口腔医学院·口腔医院口腔颌面外科的OKC患者,10例为痣样基底细胞癌综合征性OKC(女性4例,男性6例),20例为散发性OKC(女性7例,男性13例)。采集患者的病变组织,分离衬里上皮和纤维间质,采用Sanger测序法分别检测上皮与间质DNA中smo基因突变情况。结果检测发现3个smo基因突变位点,即1例综合征性OKC携带c.2081C>G(p.P694R)突变,2例散发性OKC分别携带c.907C>T(p.L303F)突变和c.1247_1248delinsAA(p.G416E)突变,前2例突变为未被报道过的smo新突变,且2例散发性OKC均不伴PTCH1突变。结论除PTCH1突变外,OKC还存在smo基因突变,可能与OKC的发病机制有关。

关键词：牙源性囊肿牙源性角化囊肿 smo基因基因突变 SHH通路抑制剂

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smo基因突变在成釉细胞瘤中的研究进展

国际口腔医学杂志 2020年第1期47卷 63-67页

作者：何优雅季彤上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面-头颈肿瘤科国家口腔疾病临床医学研究中心上海市口腔医学重点实验室上海市口腔医学研究所

smo基因编码的蛋白质smo是sonic hedgehog(SHH)信号通路中至关重要的信号转换器。SHH信号通路与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关,异常激活的SHH信号通路通过影响细胞的增殖、分化和凋亡,导致肿瘤发生。研究发现在成釉细胞瘤中,smo基... 详细信息

smo基因编码的蛋白质smo是sonic hedgehog(SHH)信号通路中至关重要的信号转换器。SHH信号通路与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关,异常激活的SHH信号通路通过影响细胞的增殖、分化和凋亡,导致肿瘤发生。研究发现在成釉细胞瘤中,smo基因是除BRAF基因之外第二常见突变的基因,其较高的突变率使得smo基因成为成釉细胞瘤分子病理研究领域中的热点。现在已有大量的研究证实,smo基因突变与成釉细胞瘤的临床特征(如发病部位、组织学、年龄和预后等)有关,这些研究结果为成釉细胞瘤的靶向治疗提供了新的治疗思路,本文就smo基因突变在成釉细胞瘤中的研究进展及其潜在的临床意义进行综述。

关键词： smo基因 sonic hedgehog信号通路成釉细胞瘤基因突变

smo基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞smo基因表达的影响

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SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达...

作者：迪力夏提·吐尼牙孜（Dilxat Tuniyaz）新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:构建携带smo靶向siRNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中smo基因表达的抑制作用。方法:设计并合成3条smo基因靶向siRNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰... 详细信息

目的:构建携带smo靶向siRNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中smo基因表达的抑制作用。方法:设计并合成3条smo基因靶向siRNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测smo基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测smo蛋白表达。结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成smo靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×108TU/ML,1.49×109TU/ML及8.50×108TU/ML,经转染SW1990细胞后,测定对smo基因表达的抑制率分别为86.00%,74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对smo蛋白表达的抑制率>80%。结论:成功构建携带smo基因靶向siRNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中smo基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具。

关键词：胰腺癌 smo基因 siRNA 慢病毒表达载体

实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病患者Shh、smo基因的表达水平

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第三军医大学学报 2014年第3期36卷 267-269页

作者：朱华民李扬秋暨南大学医学院血液病研究所广州510632 广东医学院附属医院急救中心广东湛江524001 暨南大学再生医学教育部重点实验室广州510632

目的建立Hedgehog信号通路功能性基因Shh和功能性受体蛋白smo基因的定量检测方法,并分析其在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者中的表达水平。方法利用实时定量PCR检测20例CML患者和作为正常对照(8例)的健康人外周血... 详细信息

目的建立Hedgehog信号通路功能性基因Shh和功能性受体蛋白smo基因的定量检测方法,并分析其在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者中的表达水平。方法利用实时定量PCR检测20例CML患者和作为正常对照(8例)的健康人外周血细胞中Shh、smo基因的表达水平,以β2微球蛋白(β2-M)基因作为内对照。结果 CML组Shh、smo表达水平均明显高于正常对照组(Psmo基因的定量检测方法;Shh、smo基因在CML中高表达。

关键词： Shh smo基因慢性粒细胞白血病实时定量PCR 基因表达

沉默smo基因对人宫颈癌HeLa细胞活力及凋亡的影响

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中国病理生理杂志 2017年第11期33卷 2015-2019页

作者：宋凌周强李娜余洁李阳张翅商丘医学高等专科学校河南商丘476100 郑州市儿童医院河南郑州450052

目的:使用RNA干扰技术沉默smoothened(smo)基因,探讨其对宫颈癌He La细胞活力和凋亡的影响。方法:采用smo shRNA转染宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测各组He La细胞smo和转录因子Gli1的mRNA和蛋白表达;采用MTT比色法... 详细信息

目的:使用RNA干扰技术沉默smoothened(smo)基因,探讨其对宫颈癌He La细胞活力和凋亡的影响。方法:采用smo shRNA转染宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测各组He La细胞smo和转录因子Gli1的mRNA和蛋白表达;采用MTT比色法测定沉默smo后细胞生长的情况;流式细胞术检测smo shRNA对细胞周期和凋亡的影响。结果:与对照组比较,smo shRNA转染细胞72 h后,smo和Gli1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(Psmo基因沉默后,He La细胞的活力明显降低,细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高。结论:沉默smo基因可有效抑制人宫颈癌He La细胞生长,并诱导其凋亡。

关键词： smo基因宫颈癌 RNA干扰细胞凋亡

藏系绵羊smo基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步分析

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藏系绵羊Smo基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步...

作者：于淼西南民族大学

学位级别：硕士

本研究的目的是构建藏系绵羊smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体,在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究藏系绵羊smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象... 详细信息

本研究的目的是构建藏系绵羊smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体,在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究藏系绵羊smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象,从皮肤中克隆了smo基因序列,根据基因的CDS区构建了皮肤特异性真核表达载体及3个干扰载体,随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(Human hair inner root sheath cells,HHIRSC),利用荧光定量PCR技术检测藏系绵羊smo基因以及smo基因所在Hh通路的两个下游基因(Gli1、Gsk3β)m RNA水平的变化。主要研究成果如下:(1)获得了藏系绵羊smo基因的编码区序列(CDS),长度为2342 bp。CDS区比对显示,smo基因与预测的绵羊smo基因序列有3个碱基差异,编码的蛋白质序列有1个氨基酸差异。(2)以p CDs Red2-KI真核载体为基础,构建了含KAP6.1皮肤特异表达启动子的smo基因重组真核载体p CDs Red2-KS;以线性质粒pc DNA6.2-GW/Em GFP-mi R为主体,构建了3个干扰载体。(3)将表达载体和3个干扰载体分别转染HHIRSC,经荧光定量PCR检测转染结果,显示藏系绵羊smo基因在转染p CDs R-KS载体的HHIRSC中高表达,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著上调(Psmo基因均有98%以上的沉默效应,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著下调(Psmo基因功能的细胞水平研究。研究结果提示,藏系绵羊smo基因可能通过Hh通路影响毛囊的发育或周期变化。

关键词：藏系绵羊 smo基因真核载体干扰载体 Gli1基因 Gsk3β基因

siRNA干扰smo基因对人肝癌HepG2细胞生物学特性影响的研究

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siRNA干扰Smo基因对人肝癌HepG2细胞生物学特性影响的研究

作者：张雷蚌埠医学院

学位级别：硕士

肝癌是世界常见恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最主要的类型，其特点是侵袭力强、易转移、预后差，它由多种基因参与，涉及多条信号通路。在我国，肝癌发病率极高，约占全世界的42.5%。自20世纪90年代以来... 详细信息

肝癌是世界常见恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最主要的类型，其特点是侵袭力强、易转移、预后差，它由多种基因参与，涉及多条信号通路。在我国，肝癌发病率极高，约占全世界的42.5%。自20世纪90年代以来，我国肝癌死亡率为20～40/10万，高居癌症死亡率的第2位，且5年生存率极低。大量实验证明，肝癌的发生是由多种基因参与，涉及多条信号通路的多步骤、多阶段的发生过程，但目前发病机制尚不清楚。且对于肝癌的早期诊断及治疗也缺乏有效的手段。通过对肝癌相关的基因研究，不仅可以进一步明确肝癌的发生机制，以及提供新的靶向生物治疗肝癌。近年来，研究发现很多在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路同样在肿瘤发生的过程中发挥着重要的作用，其中包括Sonichedgehog信号通路、EGFR信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。这些通路的发现和研究，为肿瘤发生机制的研究及新的治疗途径提供了新方向。 smoothened(smo)蛋白是Sonichedgehog信号通路中的信息转换器，能够把细胞外的SHh信号转换成细胞内的Glil信号，从而启动细胞核内基因的转录，对Sonichedgehog信号通路具有激活作用。正常组织和细胞中，smo不表达或低表达，维持细胞正常代谢需要。当smo过表达时，可异常激活Hedgehog通路，产生大量促癌因子，使细胞发生转化和恶变。研究表明，smo在一些人类肿瘤，如恶性胶质瘤、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、基底细胞癌等组织中高表达。有学者认为，smo有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和早期诊断、评估预后的新指标。本课题拟应用Westernblot及半定量RT-PCR技术，旨在观察smo基因在肝癌HepG2细胞中的表达及其对肝癌HepG2细胞影响的作用。RT-PCR及Westemblot检测肝癌HepG2细胞中smo基因的表达;利用RNAi技术siRNA脂质体介导转染肝癌HepG2细胞，MTT法和流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞smomRNA被降解后对细胞的影响。探讨smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用。目的：探讨smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及与肝癌的关系，为smo基因在Sonichedgehog信号通路上能否靶向治疗肝癌提供实验依据。材料和方法： 1.细胞来源：本实验所使用的人肝癌HepG2细胞株由安徽医科大学老师赠与。试剂：Trizol（总RNA提取试剂异硫氰酸胍)、FSK-100(RT-PCR试剂盒)、兔抗人smo浓缩型多克隆抗体（一抗）、Annexin-V凋亡检测试剂盒、辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(二抗)、MTT等。主要设备：C02恒温孵育箱、PCR扩增仪、流式细胞仪、转印电印电泳槽、DYY-B型电泳仪。 2.实验方法：(1)细胞培养:HepG2细胞在培养基(含1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和1.5克/升碳酸氢钠的EMEM，添加10%胎牛血清。)于37℃、5％CO2孵箱中培养，实验所用细胞均处于对数生长期。（2）RT-PCR检测肝癌HepG2细胞smomRNA的表达（3）Westernblot检测HepG2细胞smo蛋白的表达（4）siRNA序列的设计与合成：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1对非特异性siRNA（5）细胞转染及siRNA筛选：分成A、B、C、D、E五组：A组为转染特异性siRNA-1组，B组为转染特异性siRNA-2组、C组为转染特异性siRNA-3组，D组为阳性对照组(转染非特异性siRNA)，E组为阴性对照组(转染时只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每组设6个重复孔。(6)RNAi技术分别将smosiRNA转染入各组人肝癌HepG2细胞内;(7)RT-PCR技术检测转染48小时后各组细胞的smomRNA表达，比较3组特异组表达的效果，筛选出抑制最有效的siRNA，后继实验中均以该特异性siRNA转染的细胞为实验组;(8)再将HepG2细胞分成实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组设6个重复孔进行转染;（9）噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡率;（10）统计学方法分析：数据采用SPSSl8．0软件进行统计分析。结果： l、Westernblot及半定量RT-PCR结果显示发现人肝癌HepG2细胞内有smo蛋白及smomRNA的高表达。 2、按照分组，转染48h后，RT-PCR结果显示：siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组及阳性对照组与阴性对照组的HepG2细胞的smomRNA表达水平有显著性差异(F=382.0，P<0．001)，siRNA-1组表达水平最低，siRNA-2组次之，两组分别与阴性

关键词：肝癌 Sonichedgehog信号通路 smo基因 siRNA RNAi

藏系绵羊smo基因的克隆测序及其功能的细胞水平验证

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西南民族大学学报（自然科学版） 2021年第5期47卷 462-468页

作者：郑玉才于淼金素钰黄林西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041

实验目的是构建藏系绵羊smoothened(smo)基因的皮肤特异表达载体和干扰载体,并探索其在毛囊细胞中的调控机制.试验从成年藏系绵羊(n=5)皮肤中克隆了smo基因,获得的编码区长度为2342 bp,编码779个氨基酸,与绵羊预测的smo基因在序列上高... 详细信息

实验目的是构建藏系绵羊smoothened(smo)基因的皮肤特异表达载体和干扰载体,并探索其在毛囊细胞中的调控机制.试验从成年藏系绵羊(n=5)皮肤中克隆了smo基因,获得的编码区长度为2342 bp,编码779个氨基酸,与绵羊预测的smo基因在序列上高度相似;试验构建了该基因含KAP6.1启动子的皮肤特异表达载体pCDsRed2-KS和3个干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRⅠ-Ⅲ;随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(HHIRSC),获得的转染效率均在约40%,转染48 h后从HHIRSC中提取总RNA,用定量PCR检测smo基因及Hh通路中Gli1和Gsk3β的mRNA水平.结果显示,藏系绵羊smo基因在转染表达载体的HHIRSC中获得超表达,与对照组相比,其mRNA水平提高约5900倍,同时Gli1、Gsk3β基因的mRNA水平也表现出极显著上调(Psmo基因的沉默效率均在98%以上,同时Gli1和Gsk3β的mRNA水平极显著下调(Psmo基因可能通过Hh通路影响毛囊细胞功能.

关键词：藏系绵羊 smo基因毛囊信号转导