藏系绵羊Smo基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步分析

作     者：于淼 

作者单位：西南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑玉才

授予年度：2016年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：藏系绵羊 Smo基因 真核载体 干扰载体 Gli1基因 Gsk3β基因 

摘      要：本研究的目的是构建藏系绵羊Smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体,在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究藏系绵羊Smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象,从皮肤中克隆了Smo基因序列,根据基因的CDS区构建了皮肤特异性真核表达载体及3个干扰载体,随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(Human hair inner root sheath cells,HHIRSC),利用荧光定量PCR技术检测藏系绵羊Smo基因以及Smo基因所在Hh通路的两个下游基因(Gli1、Gsk3β)m RNA水平的变化。主要研究成果如下:(1)获得了藏系绵羊Smo基因的编码区序列(CDS),长度为2342 bp。CDS区比对显示,Smo基因与预测的绵羊Smo基因序列有3个碱基差异,编码的蛋白质序列有1个氨基酸差异。(2)以p CDs Red2-KI真核载体为基础,构建了含KAP6.1皮肤特异表达启动子的Smo基因重组真核载体p CDs Red2-KS;以线性质粒pc DNA6.2-GW/Em GFP-mi R为主体,构建了3个干扰载体。(3)将表达载体和3个干扰载体分别转染HHIRSC,经荧光定量PCR检测转染结果,显示藏系绵羊Smo基因在转染p CDs R-KS载体的HHIRSC中高表达,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著上调(P0.01);3个干扰载体对Smo基因均有98%以上的沉默效应,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著下调(P0.01)。本研究结果表明,藏系绵羊皮肤特异真核表达载体p CDs R-KS和3个干扰载体均构建成功,可用于Smo基因功能的细胞水平研究。研究结果提示,藏系绵羊Smo基因可能通过Hh通路影响毛囊的发育或周期变化。