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用于苹果树病毒鉴定的small rna深度测序数据集

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农业大数据学报 2022年第2期4卷 25-29页

作者：胡国君董雅凤张尊平范旭东任芳中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心兴城125100

病毒病是为害苹果的重要致病因子,开展病毒种类鉴定是防控苹果病毒病的首要任务。由于苹果长期通过嫁接的方式进行繁育,导致树体感染多种病毒,加之苹果病毒的浓度较低,序列变异较大,致使苹果病毒种类的鉴定尤为困难。此外,现有的分子检... 详细信息

病毒病是为害苹果的重要致病因子,开展病毒种类鉴定是防控苹果病毒病的首要任务。由于苹果长期通过嫁接的方式进行繁育,导致树体感染多种病毒,加之苹果病毒的浓度较低,序列变异较大,致使苹果病毒种类的鉴定尤为困难。此外,现有的分子检测技术主要为聚合酶链式反应和分子杂交技术,这些技术基于已知病毒核苷酸序列为基础开展鉴定,而对于未知病毒,由于其核苷酸序列尚未测定,则无法采用这些分子技术进行鉴定。针对这一瓶颈,该文提供了一个自然生长的苹果树的small rna (srna)深度测序的数据集,通过结合生物信息学方法对原始数据进行过滤、srna组装及Blast比对,可准确地分析和判断自然条件下病毒的种类,为苹果病毒的鉴定带来了新的突破,同时也为苹果无毒苗木的判定提供技术支撑。

关键词：苹果病毒鉴定 small rna测序生物信息学

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新城疫病毒感染鸡胚组织mirnas表达谱的测序及分析

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动物医学进展 2022年第8期43卷 19-24页

作者：贾燕青仇薪鑫王相伟谢晓刚白军王兴龙杨增岐杨凌职业技术学院动物工程分院/动物疫病防控陕西省高校工程研究中心陕西杨凌712100 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为了阐明新城疫病毒(NDV)感染鸡胚后mirnas表达谱的变化及NDV感染与宿主基因之间的相互作用,帮助寻找NDV防控的新靶点和方法。通过small rna测序技术获得NDV强毒株(F48E9)和弱毒株(La Sota)感染的鸡胚内脏组织mirnas表达谱。对差异表达... 详细信息

为了阐明新城疫病毒(NDV)感染鸡胚后mirnas表达谱的变化及NDV感染与宿主基因之间的相互作用,帮助寻找NDV防控的新靶点和方法。通过small rna测序技术获得NDV强毒株(F48E9)和弱毒株(La Sota)感染的鸡胚内脏组织mirnas表达谱。对差异表达的mirnas进行分析发现,F48E9感染引起了33个mirnas上调,31个mirnas下调;La Sota感染引起36个mirnas上调,25个mirnas下调;La Sota与F48E9感染组比较,有27个mirnas上调,22个mirnas下调。选取10个差异表达mirnas进行RT-qPCR验证,gga-miR-34a-5p、gga-miR-375、gga-miR-122-3p、gga-miR-187-3p、gga-miR-124a-3p、gga-miR-203a、gga-miR-205a、gga-miR-183、gga-miR-9-3p和gga-miR-451表达量与small rna测序结果相似。对差异表达mirnas进行靶基因预测和生物信息学富集分析发现,在NDV感染鸡胚时,差异表达的mirnas主要参与调控细胞生长代谢、细胞周期及免疫和炎症反应等通路。研究结果分析了NDV感染后mirnas表达变化及预测功能,为NDV防控研究提供参考。

关键词：新城疫病毒 small rna测序 mirna 实时荧光定量PCR

基于转录组与小rna测序的库尔勒香梨病毒检测

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基于转录组与小RNA测序的库尔勒香梨病毒检测

作者：杨洁萍石河子大学

学位级别：硕士

目的:通过高通量测序技术对库尔勒香梨花朵进行转录组测序和small rna测序,筛选出与植物病毒相关的基因序列作为候选病毒分析,并通过RT-PCR技术对筛选到有关病毒的基因序列进行验证。探索分析库尔勒香梨病毒的基因序列相关信息的新方法... 详细信息

目的:通过高通量测序技术对库尔勒香梨花朵进行转录组测序和small rna测序,筛选出与植物病毒相关的基因序列作为候选病毒分析,并通过RT-PCR技术对筛选到有关病毒的基因序列进行验证。探索分析库尔勒香梨病毒的基因序列相关信息的新方法,为库尔勒香梨病毒的检测、病毒防治和培育无病毒苗木奠定基础。方法:将2014年、2017年、2018年4月中旬,采集的库尔勒香梨花朵分别于当年送至诺禾致源公司,委托其利用Illumina HisSeq2500测序平台进行转录组测序。将获得的原始序列过滤剔除低质量数据得到干净序列后,采用Trinity软件对干净序列进行拼接。Trinity拼接得到的转录本序列,Corset利用比对到转录本的序列和表达模式对转录本进行层次聚类,以Corset层次聚类后最长Cluster序列进行基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的长片段序列作为候选病毒,对候选病毒病毒序列设计引物进行RT-PCR验证;将2014年所获得的小rna测序数据,所得的原始序列进行测序数据过滤,得到的为干净序列。在NCBI的GenBank数据库下载各种植物病毒的参考序列,将干净序列用本地BLAST程序与核酸数据库、蛋白数据库进行比对,筛选出和植物病毒序列相似性比较高的序列,从而得到候选病毒进行分析。研究结果如下:1、库尔勒香梨转录组测序分析根据三组转录组测序数据的生物信息学分析结果,对分别筛选出的66条、202条、921条注释为植物病毒的基因序列和1条注释为植物类病毒的基因序列分析,发现有3种是已报道的侵染梨的病毒和1种类病毒,分别是苹果茎痘病毒分离物PA66、苹果茎沟病毒分离物P-209、苹果茎沟病毒韩国分离物、苹果褪绿叶斑病毒、啤酒花矮化类病毒,一种未报道的病毒芸薹黄化病毒。根据设计的特异性引物,随机采集的库尔勒香梨枝条样品利用RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,只有苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒扩增出目的片段。2、库尔勒香梨small rna测序分析运用BLAST程序将获得的干净序列分别与NCBI的核酸数据库和蛋白质数据库进行比对,筛选出了22条注释为植物病毒的基因序列和32条注释为植物类病毒的基因序列进行分析,发现2种已报道的侵染梨的病毒和1种类病毒,分别为苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果锈果类病毒。

关键词：库尔勒香梨转录组测序 small rna测序病毒

赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)响应病毒感染的microrna转录组分析

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遗传 2021年第11期43卷 1088-1100,I0020-I0053页

作者：张恩权蔡伟聪李桂玲李健刘静雯集美大学食品与生物工程学院厦门361000

海洋颗石藻病毒–宿主互作是影响海洋碳、硫生物地化循环及全球气候变化的重要环节。作为大的双链DNA病毒,颗石藻病毒进化出一种“病毒细胞代谢”模式,通过重编程宿主代谢途径以满足其代谢需求,但对这一代谢模式的调控机制尚缺乏足够的... 详细信息

海洋颗石藻病毒–宿主互作是影响海洋碳、硫生物地化循环及全球气候变化的重要环节。作为大的双链DNA病毒,颗石藻病毒进化出一种“病毒细胞代谢”模式,通过重编程宿主代谢途径以满足其代谢需求,但对这一代谢模式的调控机制尚缺乏足够的认识。Microrna(mirna)作为一种基因表达调控的重要因子,能够通过调控代谢过程中的靶基因表达,从而调节相关代谢通路。本研究采用small rna测序技术分析病毒感染颗石藻差异表达的mirna及其靶基因功能,鉴定出26条成熟mirna(包括2条病毒来源的mirna),均来自23条新的mirna前体序列,其中5条mirna显著差异表达,包括4条上调,1条下调。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证结果与mirna-seq结果基本一致。功能富集分析显示,5个差异表达的mirna可能参与调节糖代谢、脂代谢和氨基酸等代谢。此外,差异表达mirna的表达水平与脂质代谢相关靶基因如ACC-1、SPT、ACOX、ACAT、CERS、ACADS等的表达水平呈负相关,说明这些mirna可能在病毒感染过程中对宿主的脂质代谢发挥重要的调控作用。

关键词：赫氏颗石藻颗石藻病毒 small rna测序 microrna 脂代谢

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsrna筛选与大量制备

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中国农业科学 2021年第6期54卷 1143-1153页

作者：徐翔解屹宋丽云申莉莉李莹王勇刘明宏刘东阳王小彦赵存孝王凤龙杨金广中国农业科学院烟草研究所四川省烟草公司凉山州公司贵州省烟草公司遵义市公司甘肃省烟草公司庆阳市公司

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsrna,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsrna,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接... 详细信息

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsrna,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsrna,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总rna和蛋白质,以CP基因mrna水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsrna对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟(Nicotiana tabacum var. Samsun NN)上的过敏性坏死反应(hypersensitive necrosis reaction),通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsrna,筛选出高效抑制TMV的dsrna片段。为了获取大量的dsrna,将dsrna对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至rnase III缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)HT115(DE3)中,并对原核表达制备的dsrna喷施烟草后生成的sirna进行深度测序,比较外源施用dsrna后,对TMV侵染的small rna表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsrna RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的 dsrna的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsrna,菌液中提取的dsrna喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小rna测序结果显示TMV侵染引起的rnai过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生sirna,而外源性dsrna的浸润会引起靶向区域sirna的富集,sirna反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsrna的施用能够引起sirna表达丰度的变化。【结论】通过比较dsrna介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsrna序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsrna能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsrna原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsrna在植物病毒方面的防治应用打下了基础。

关键词：烟草花叶病毒 rna干扰 dsrna small rna测序原核表达

花生荚果发育过程中的microrna鉴定与表达分析

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作物学报 2021年第4期47卷 613-625页

作者：胡冬秀刘浩洪彦彬梁炫强陈小平广东省农作物遗传改良重点实验室/国家油料作物改良中心南方分中心/广东省农业科学院作物研究所广东广州510640

花生(Arachis hypogaea L.)是典型“地上开花、地下结果”的作物,为从转录后调控水平解析此独特的果实发育现象,本文应用small rna测序技术研究荚果发育11个时期果壳及种子中的microrna及其靶基因。通过测序分别获得212个已知的microrna... 详细信息

花生(Arachis hypogaea L.)是典型“地上开花、地下结果”的作物,为从转录后调控水平解析此独特的果实发育现象,本文应用small rna测序技术研究荚果发育11个时期果壳及种子中的microrna及其靶基因。通过测序分别获得212个已知的microrna和112个新microrna,其中,已知microrna包括197个保守microrna和15个花生特异microrna,新microrna来自62个新的microrna前体序列。表达分析发现,67个microrna及其靶基因在荚果发育的11个时期存在时空特异性表达,部分microrna的表达量积累阶段性调节果壳与种子的发育,表明microrna参与了花生荚果暗发育的整个过程。此外,对28个microrna与30个靶基因进行荧光定量PCR验证发现,microrna和靶基因的表达趋势与测序结果基本一致。本研究通过对花生荚果不同发育时期的果壳和种子进行small rna测序,鉴定参与调控花生荚果膨大相关的microrna,为研究黑暗条件下植物果实发育的调控机制与花生遗传改良奠定理论基础。

关键词：花生荚果发育 small rna测序 microrna 靶基因

mirna对褐飞虱鞘脂质代谢基因表达的影响及沉默NlSPT1和Nl SMase4的small rna分析

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中国农业科学 2024年第20期57卷 4022-4034页

作者：王妮施哲逸尤元政张超周文武周瀛祝增荣浙江大学农业与生物技术学院昆虫科学研究所/水稻生物育种全国重点实验室/农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室浙江大学海南研究院浙江余杭稻米科技小院新疆农业大学农学院农业有害生物监测与安全防控重点实验室

【背景】鞘脂质是第二大类膜脂，作为信号转导物质参与细胞生长发育、繁殖及凋亡等过程。鞘脂质代谢酶调控鞘脂质代谢以维持生物体内代谢的稳态。【目的】以重要水稻害虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）为研究对象，通过rna干扰（rna inte... 详细信息

【背景】鞘脂质是第二大类膜脂，作为信号转导物质参与细胞生长发育、繁殖及凋亡等过程。鞘脂质代谢酶调控鞘脂质代谢以维持生物体内代谢的稳态。【目的】以重要水稻害虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）为研究对象，通过rna干扰（rna interference,rnai）技术检测微小rna(microrna,mirna)生物合成通路核心组分NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha沉默后褐飞虱鞘脂质代谢通路相关基因的相对转录水平，结合small rna测序分析沉默丝氨酸棕榈酰转移酶1(serine palmitoyltransferase 1,SPT1)和鞘磷脂酶4(sphingomyelinase 4,SMase4)基因的差异mirna，探究mirna在褐飞虱鞘脂质代谢中的作用，为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】利用rnai技术，分别对羽化后第1天（1 PAE,post adult eclosion）的雌成虫NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha进行dsrna注射，以ds GFP为对照；分别解剖羽化后第5天的卵巢组织，以β-actin作为内参基因，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha沉默后鞘脂质代谢通路相关基因的表达量变化；根据已有的小rna文库联合mirna-靶基因预测软件对可能调控NlSPT1和NlSMase4表达的mirna进行预测；通过small rna测序技术对沉默NlSPT1和NlSMase4的差异mirna进行鉴定和靶基因富集性分析。【结果】与对照组相比，沉默NlAgo1、NlDicer1或NlDrosha显著上调卵巢中NlSPT1和NlSMase4等鞘脂质代谢通路相关基因的表达；靶基因预测结果显示，有6条mirna能与NlSPT1结合，13条mirna能与NlSMase4结合；沉默NlSPT1和NlSMase4的差异mirna的靶基因显著富集在细胞核和蛋白质结合等生物学过程以及内吞作用、内质网加工、MAPK信号通路、TOR信号通路、凋亡、脂质代谢等代谢通路。【结论】NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha依赖性的mirna通过影响鞘脂质代谢相关基因的表达影响鞘脂质代谢。NlSPT1和NlSMase4沉默引起褐飞虱卵巢mirna表达水平的改变。研究结果可为基于鞘脂质代谢基因为靶标的害虫防治提供理论依据。

关键词：褐飞虱微小rna 鞘脂质 rna干扰 small rna测序

枣树阶段转变相关microrna家族的鉴定及其表达分析

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园艺学报 2022年第1期49卷 23-40页

作者：李莹孟宪巍马志航刘孟军赵锦河北农业大学中国枣研究中心河北保定071000 河北农业大学园艺学院河北保定071000 河北农业大学生命科学学院河北保定071000

与其他果树相比,枣树具有童期短、成花快的特征。已有研究表明,多个microrna (mirna)家族参与植物阶段转变和开花时间调控等过程。研究枣树阶段转变相关的mirna家族对果树童斯调控具有重要意义。以枣实生后代植株不同发育阶段(节位)的... 详细信息

与其他果树相比,枣树具有童期短、成花快的特征。已有研究表明,多个microrna (mirna)家族参与植物阶段转变和开花时间调控等过程。研究枣树阶段转变相关的mirna家族对果树童斯调控具有重要意义。以枣实生后代植株不同发育阶段(节位)的当年生枝(枣吊)为材料,通过small rna测序,在童期、过渡期和成年期等3个时期鉴定出27个mirna家族的58个已知mirna.和23个新mirna,其中44个差异表达的mirna包括32个已知mirna和12个新mirna;然后,从中筛选出不同时期显著差异表达的6个mirna,即zjmiR156a-5p、zjmiR156j、zjmiR172c、zjmiR172e-3p、zjmiRnove1-16和zjmiRnove1-71,通过TargetFinder软件预测出它们的15个关键靶基因,其主要参与成花、转录调控和生物合成等过程;利用实时荧光定量PCR分析验证了12个mirna及15个关键靶基因确实在枣树阶段转变中差异表达,并存在正调控或负调控关系,其中2个新mirna(zjmiRnove1-16和zjmiRnove1-71)可能分别通过光周期和糖代谢途径影响阶段转变。

关键词：枣阶段转变 microrna 靶基因 small rna测序

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小麦温敏不育系BNS366育性转换的microrna鉴定及表达分析

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小麦温敏不育系BNS366育性转换的microRNA鉴定及表达分析

作者：胡雪华中农业大学

学位级别：硕士

Microrna是一类普遍存在于真核生物中的非编码的内源小分子rna,主要在转录后水平对基因的表达起负调控作用。研究表明mirna广泛参与植物的生长发育过程,其中一些特定的mirna参与植物的花药发育,是导致花药发育异常,雄性不育的重要原因... 详细信息

Microrna是一类普遍存在于真核生物中的非编码的内源小分子rna,主要在转录后水平对基因的表达起负调控作用。研究表明mirna广泛参与植物的生长发育过程,其中一些特定的mirna参与植物的花药发育,是导致花药发育异常,雄性不育的重要原因。目前,对于mirna在花药发育方面的研究大部分集中在水稻、棉花、油菜等作物上,而小麦是基因组复杂的异源六倍体,其mirna调控不育机理相关研究报道较少。因此,研究调控小麦雄性不育的mirna,对解析小麦雄性不育的机理具有重要的意义。本研究以小麦温敏雄性不育系BNS366在低温不育条件和正常可育条件下的花药为材料,通过small rna测序技术鉴定到一些小麦BNS366花药在不同育性中差异表达显著的mirnas,并且利用生物信息学手段对差异表达的mirnas以及相应的靶基因进行筛选和初步的功能分析,主要研究结果如下:1.小麦不育系BNS366不同播期的育性表现:分别在10月、11月、12月和1月中旬对小麦BNS366进行大田播种,4个播期的结实率分别为14.76%、28.83%、42.5%和84.1%。同时,对不同播期小麦BNS366的花粉进行细胞学观察,其中第I期,花粉粒干瘪,且I2-KI染色呈黄褐色,绝大部分表现不育;到第Ⅳ期时,绝大部分花粉被染成蓝黑色,花粉表现可育。2.小麦BNS366不同育性花药的small rna测序:取不同时期不育和可育花粉构建NN1(可育花粉母细胞时期)、NN2(可育四分体时期)、SL1(不育花粉母细胞时期)和SL2(不育四分体时期)4个文库,测序共获得54,318,314个raw reads,过滤后,SL1,SL2,NN1 和 NN2 文库分别有 11,858,471,13,455,460,13,823,035 和14,434,405个cleanreads。经比对共鉴定到929个mirnas,包括81个已知mirnas和 848 个新 mirnas。3.差异表达mirnas筛选:通过表达量的显著性分析,从81个已知mirnas中筛选到21个差异表达的mirnas,另外从848个新的mirnas中选择到8个差异表达倍数最大的新mirnas,共得到29个差异表达的mirnas。通过对这29个差异表达的mirnas靶基因进行预测,共得到1068个靶基因,其中有25个靶基因在小麦穗部高表达或特异表达,它们主要受到13个mirnas的调控。***对mirna和靶基因分析:利用实时荧光定量PCR分析发现miR9662a、miR5062、miR9662b、miR9653a 和 miR9672b 这 5 个 mirnas 与其潜在调控的靶基因 TraesCS6B02G028000、TraesCS5D02G192700、TraesCS6B02G043100、TraesCS3B02G251700和TraesCS7D02G383200在小麦 BNS366不同育性花药中表现为相反的表达模式,其中,TraesCS3B02G251 700和TraesCS7D02 G383200在穗生长早期阶段、花发育和减数分裂时期维持较高的表达水平,推测其可能在小麦BNS366的育性转换过程中发挥重要作用。***的功能分析:分别对7个已报道与育性相关的mirnas(miR395b、miR5062、miR9672b、miR9676、miR531、miR9653a、miR9670)进行启动子克隆和拟南芥遗传转化。通过对启动子元件预测,发现这些基因的启动子中大多含有低温响应元件LTR或脱落酸响应元件ABRE。同时,对7个mirnas在拟南芥中进行转化,完成了阳性转化材料筛选,后续通过对这些mirnas组织表达模式分析来解析BNS366的育性调控机制。综上,本研究通过small rna测序技术对温敏雄性不育小麦BNS366在不育和可育条件下的花药mirna表达谱进行分析,发现了一些可能参与小麦BNS366育性调控的mirnas,并挖掘了参与BNS366育性转换的潜在靶基因,为后续解析mirna对温敏雄性不育小麦BNS366的不育机制提供参考。

关键词：小麦BNS366 mirna 靶基因花药发育 small rna测序基因克隆