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应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

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中国农业科学 2020年第15期53卷 3146-3157页

作者：原贵波莫双榕钱莹臧栋楠杨帆蒋红亮武媛丁海东扬州大学生物科学与技术学院

【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一... 详细信息

【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的Bam HⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。

关键词：番茄 SlVQ6 SlMPK1 pull-down 互作蛋白

GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用

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兰州大学学报（自然科学版） 2013年第6期49卷 828-832页

作者：黄聪琳丁硕姜华安黎哲甘肃省中医院兰州730050 甘肃省中医药研究院兰州730050 兰州大学生命科学学院兰州730000

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组... 详细信息

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础.

关键词： CBL1蛋白 GST pull-down CIPK7蛋白蛋白质相互作用

应用pull-down方法获得鸡B-LB分子中结合恒定链的活性片段

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农业生物技术学报 2016年第10期24卷 1474-1481页

作者：储稳罗兰芳吕邑旺余为一陈芳芳安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室

本研究旨在探明鸡(Gallus gallus)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子(B分子)中与恒定链(invariant chain,Ii)结合的活性片段,以了解和深入研究Ⅱ类分子与Ii在递呈抗原肽中的作用机理。从实验室保存的... 详细信息

本研究旨在探明鸡(Gallus gallus)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子(B分子)中与恒定链(invariant chain,Ii)结合的活性片段,以了解和深入研究Ⅱ类分子与Ii在递呈抗原肽中的作用机理。从实验室保存的B-LB基因的c DNA克隆了3个结构片段分别插入原核和真核表达质粒,再将其分别转染或者与Ii共转染工程菌Rosetta(DE3),诱导表达后先后用亲和层析和拉下法(pull-down)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测其纯度和形成的复合物。然后用免疫印迹(Western blot)验证复合物的性质以及真核表达验证这些片段在细胞内的表达和定位。首先,构建的3个重组质粒p GEX-4T-1-B-LB-Sβ1、p GEX-4T-1-B-LB-β1和p GEX-4T-1-B-LB-β2TC均能单一表达目的蛋白B-LB-Sβ1、B-LB-β1和B-LB-β2TC,并被纯化。其次,在共表达和pull-down中,B-LB-Sβ1和B-LB-β1能够与Ii形成复合物,而B-LB-β2TC不能与Ii结合,因为免疫印迹的结果表明,特异性抗体能识别在poll-down中被结合的这两个目的蛋白。最后在真核表达系统中,也证实B-LB-Sβ1、B-LB-β1能保持B-L分子在293T细胞的浆膜系统定位的功能,而B-LB-β2TC却丧失了该定位功能。本研究结果首次提供了Ⅱ类分子结合Ii的活性片段的证据。

关键词：恒定链 B-LB片段 pull-down 表达复合物

GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

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生物技术通报 2011年第1期27卷 202-207页

作者：侯佩莉关振宏张茂林李影段铭吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室长春130062

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(***-li)BL21中诱导表达;构建... 详细信息

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(***-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。

关键词： GST pull-down 流感病毒PB1-F2蛋白热休克蛋白40 蛋白质相互作用

FLAG pull-down技术筛选LASP-1相互作用蛋白

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广东医学 2010年第17期31卷 2237-2240页

作者：赵亮丁彦青南方医科大学南方医院病理科广州510515

目的筛选与LASP-1蛋白发生相互作用的蛋白质。方法构建携带FLAG标签的LASP-1融合表达载体,转染人结直肠癌细胞系SW480表达FLAG-LASP-1融合蛋白,用FLAG-M2亲和柱筛选并经SDS-PAGE分析差异条带,切取差异条带酶解进行质谱鉴定。结果成功构... 详细信息

目的筛选与LASP-1蛋白发生相互作用的蛋白质。方法构建携带FLAG标签的LASP-1融合表达载体,转染人结直肠癌细胞系SW480表达FLAG-LASP-1融合蛋白,用FLAG-M2亲和柱筛选并经SDS-PAGE分析差异条带,切取差异条带酶解进行质谱鉴定。结果成功构建pcDNA3-FLAG-LASP-1真核表达载体,转染SW480细胞表达FLAG-LASP-1融合蛋白,SDS-PAGE电泳分离得到8个差异蛋白条带,质谱鉴定LASP-1相互作用蛋白78 kDa葡萄糖调控蛋白(GRP78)和热休克同源蛋白71(HSC71)。结论 GRP78、HSC71均可能与LASP-1存在相互作用,这将为进一步研究LASP-1的功能和作用机制提供依据。

关键词： LASP-1 FLAG pull-down 相互作用蛋白蛋白质组学

GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶的互作蛋白研究

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天津化工 2018年第1期32卷 17-20页

作者：宫艳超张荟赵伟伟天津渤海职业技术学院生物与环境工程系天津300402

用GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的互作蛋白,发现了HDAC8新的互作蛋白烯醇酶ENO1,ENO1在糖代谢过程中发挥着重要作用,ENO1参与HDAC8复合物发挥作用的过程。

关键词： GST pull-down 组蛋白去乙酰化酶互作蛋白

GSTpull-down联合质谱鉴定BAG结构域相互作用蛋白

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中国生物工程杂志 2015年第4期35卷 1-10页

作者：刘冬梅孙佳楠邹佳凝刘明伟孙璐刘琼明沈阳药科大学药学院沈阳110016 国家蛋白质组学重点实验室北京蛋白质组研究中心北京102206 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

目的:BAG结构域(BAG domain,BD)为BAG家族蛋白的基本功能结构域,通过对BAG家族蛋白6个成员的9个BDs的相互作用蛋白进行分析,以探明不同BD相互作用蛋白的异同点并为研究BAG家族蛋白多样性生物功能的分子机制提供理论依据。方法:构建p-GEX... 详细信息

目的:BAG结构域(BAG domain,BD)为BAG家族蛋白的基本功能结构域,通过对BAG家族蛋白6个成员的9个BDs的相互作用蛋白进行分析,以探明不同BD相互作用蛋白的异同点并为研究BAG家族蛋白多样性生物功能的分子机制提供理论依据。方法:构建p-GEX-4T2-BDs重组子并转化*** BL21(DE3)经IPTG诱导表达GST-BDs融合蛋白并纯化。采用GST pulldown技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的策略对BDs相互作用蛋白进行定性定量分析。最后,用DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Intergrated Discovery)和cytoscape对BDs相互作用蛋白进行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes)通路分析。结果:在Hela细胞的胞浆蛋白中总共鉴定到370个潜在的BDs相互作用蛋白,主要为核糖体蛋白(ribosomal proteins)、翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factors)、翻译延长因子(Eukaryotic translation elongation factors)、泛素化-蛋白酶体相关蛋白(ubiquitin-proteasome associated proteins)及HSP40家族蛋白。GO功能富集分析结果显示,BDs相互作用蛋白涉及多种生物学功能,包括细胞内蛋白质质量控制(protein quality control)、糖代谢(glycolysis)、免疫调控(immune response)、应激反应(stress response)、细胞周期(cell cycle)等。KEGG通路分析结果表明BDs相互作用蛋白参与多条细胞内重要的信号通路,包括FGF信号通路(FGF signaling pathway)、EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)、PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)、Ras通路(Ras pathway)等。结论:BAG家族蛋白不同成员的BD所介导的蛋白-蛋白相互作用既有共性又有特异性,BAG家族蛋白通过BDs介导多种蛋白相互作用并参与细胞内多条重要的信号通路来调控细胞内蛋白质稳态、糖代谢、免疫反应、应激反应、细胞周期等过程。

关键词： BAG家族蛋白 BAG 结构域(BDs) GST pull-down LC-MS/MS

Binding of Orysata lectin induces an immune response in insect cells

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Insect Science 2022年第3期29卷 717-729页

作者： Pengyu Chen Kristof De Schutter Jarne Pauwels Kris Gevaert Els J.M.Van Damme Guy Smagghe Faculty of Bioscience Engineering Department of Plants and CropsGhent UniversityGhentBelgium Faculty of Bioscience Engineering Department of BiotechnologyGhent UniversityGhentBelgium Faculty of Medicine and Health Sciences Department of Biomolecular MedicineGhent UniversityGhentBelgium VIB Center for Medical Biotechnology GhentBelgium

In mammals,plant lectinshave been shown to possess immunomodulatory properties,acting in both the innate and adaptive immune system to modulate the production of mediators of the immune response,ultimately improving host *** present,knowledge of immunomodulatory effects of plant lectins in insects is *** of insect cells with the Orysa sativa lectin,Orysata,was previously reported to induce cell aggregation,mimicking the immune process of *** this project we investigated the potential immunomodulatory effects of this mannose-binding lectin using Drosophila melanogaster S2 *** of the Orysata binding partners on the surface of S2 cells through a pull-down assay andproteomic analysis revealed 221 putative interactors,several of which were immunity-related *** qPCR analysis revealed the upregulation of Toll-and immune deficiency(IMD)-regulated antimicrobial peptides(Drs,Mtk,AttA,and Dpt)and signal transducers(Rel and Hid)belonging to the IMD *** addition,the iron-binding protein Transferrin 3 was identified as a putative interactor for Orysata,and treatment of S2 cells with Orysata was shown to reduce the intracellular iron *** together,we believe these results offer a new perspective on the effects by which plant lectins influence insect cells and contribute to the study of their immunomodulatory properties.

关键词： cell culture immune response iron uptake Orysata plant lectin pull-down

应用GSTpull-down筛查HSF4b相互作用蛋白

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应用GSTpull-down筛查HSF4b相互作用蛋白

作者：甘冠骑华中科技大学

学位级别：硕士

白内障是最重要的人类眼科疾病,是人类失明的最主要原因。热休克蛋白4（HSF4）属于热休克转录因子（HSFs）家族,该家族成员可在热或其它应激情况时,激活热休克反应基因,调控细胞正常的生长和发育过程。HSF4基因是一个白内障致病基因,其... 详细信息

白内障是最重要的人类眼科疾病,是人类失明的最主要原因。热休克蛋白4（HSF4）属于热休克转录因子（HSFs）家族,该家族成员可在热或其它应激情况时,激活热休克反应基因,调控细胞正常的生长和发育过程。HSF4基因是一个白内障致病基因,其突变可引起先天性白内障和年龄相关性白内障。HSF4有两种可变剪接本,编码不同的亚型HSF4a和HSF4b,这两种剪接转录本可能具有不同的功能,其中HSF4b在晶状体中高度表达,被认为与白内障发生高度相关。尽管几个不同的研究小组制备了knock-out小鼠,但目前对HSF4突变引起白内障的分子机制仍不清楚。发现HSF4基因的相互作用蛋白,对于揭示HSF4突变导致白内障形成的分子机理具有重要意义。我们实验室克隆了HSF4的cDNA全长序列,并构建了晶状体细胞cDNA文库。应用酵母双杂交筛选,我们得到一些与HSF4b可能存在相互作用的蛋白,其中包括锌指转录因子143（ZNF143）,蓝白斑实验表明这两个基因存在相互作用。本研究中,我们首先选用GST pull-down试验,来验证是否HSF4b与ZNF143存在相互作用。我们构建了能表达GST-HSF4b融合蛋白的原核表达载体质粒,将其转化BL21菌株中进行表达,通过谷胱甘肽琼脂糖珠与GST的高免疫亲和性进行GST-HSF4b融合蛋白的纯化,并通过GST pull-down分析来验证HSF4b与ZNF143的相互作用,在本研究中并未检测到HSF4b与ZNF143蛋白之间的相互作用。本研究中,我们还尝试直接通过GST pull-down结合SDS-PAGE银染色分析的方法,来寻找可能与HSF4b存在相互作用的未知蛋白,对晶状体上皮细胞裂解液中拉下的蛋白进行SDS-PAGE电泳及通过银染色,我们得到了两条候选蛋白条带。我们应用GST pull-down方法,对酵母双杂交得到的HSF4b相互作用蛋白进行了验证,并应用该法来直接寻找与HSF4b相互作用的未知蛋白。我们的研究为HSF4b的功能研究提供了新的线索,进一步更深入的研究可能为揭示HSF4b的功能,阐明先天性白内障的致病机理创造良好的条件。

关键词：白内障热休克因子 4 锌指转录因子 143 蛋白质相互作用 GST pull-down