应用GSTpull-down筛查HSF4b相互作用蛋白

作     者：甘冠骑 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘木根

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：白内障 热休克因子 4 锌指转录因子 143 蛋白质相互作用 GST pull-down 

摘      要：白内障是最重要的人类眼科疾病,是人类失明的最主要原因。热休克蛋白4（HSF4）属于热休克转录因子（HSFs）家族,该家族成员可在热或其它应激情况时,激活热休克反应基因,调控细胞正常的生长和发育过程。HSF4基因是一个白内障致病基因,其突变可引起先天性白内障和年龄相关性白内障。HSF4有两种可变剪接本,编码不同的亚型HSF4a和HSF4b,这两种剪接转录本可能具有不同的功能,其中HSF4b在晶状体中高度表达,被认为与白内障发生高度相关。尽管几个不同的研究小组制备了knock-out小鼠,但目前对HSF4突变引起白内障的分子机制仍不清楚。 发现HSF4基因的相互作用蛋白,对于揭示HSF4突变导致白内障形成的分子机理具有重要意义。我们实验室克隆了HSF4的cDNA全长序列,并构建了晶状体细胞cDNA文库。应用酵母双杂交筛选,我们得到一些与HSF4b可能存在相互作用的蛋白,其中包括锌指转录因子143（ZNF143）,蓝白斑实验表明这两个基因存在相互作用。 本研究中,我们首先选用GST pull-down试验,来验证是否HSF4b与ZNF143存在相互作用。我们构建了能表达GST-HSF4b融合蛋白的原核表达载体质粒,将其转化BL21菌株中进行表达,通过谷胱甘肽琼脂糖珠与GST的高免疫亲和性进行GST-HSF4b融合蛋白的纯化,并通过GST pull-down分析来验证HSF4b与ZNF143的相互作用,在本研究中并未检测到HSF4b与ZNF143蛋白之间的相互作用。 本研究中,我们还尝试直接通过GST pull-down结合SDS-PAGE银染色分析的方法,来寻找可能与HSF4b存在相互作用的未知蛋白,对晶状体上皮细胞裂解液中拉下的蛋白进行SDS-PAGE电泳及通过银染色,我们得到了两条候选蛋白条带。 我们应用GST pull-down方法,对酵母双杂交得到的HSF4b相互作用蛋白进行了验证,并应用该法来直接寻找与HSF4b相互作用的未知蛋白。我们的研究为HSF4b的功能研究提供了新的线索,进一步更深入的研究可能为揭示HSF4b的功能,阐明先天性白内障的致病机理创造良好的条件。