应用Pull-down方法获得鸡B-LB分子中结合恒定链的活性片段
Obtaining Active Segments in Chicken（Gallus gallus） B-LB Molecule to Bind with Invariant Chain by Pull-down Method作者机构：安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室
出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)
年 卷 期：2016年第24卷第10期
页 面：1474-1481页
核心收录：
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种]
基 金：国家自然科学基金(No.31572496和No.31372417)
主 题：恒定链 B-LB片段 Pull-down 表达 复合物
摘 要：本研究旨在探明鸡(Gallus gallus)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子(B分子)中与恒定链(invariant chain,Ii)结合的活性片段,以了解和深入研究Ⅱ类分子与Ii在递呈抗原肽中的作用机理。从实验室保存的B-LB基因的c DNA克隆了3个结构片段分别插入原核和真核表达质粒,再将其分别转染或者与Ii共转染工程菌Rosetta(DE3),诱导表达后先后用亲和层析和拉下法(pull-down)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测其纯度和形成的复合物。然后用免疫印迹(Western blot)验证复合物的性质以及真核表达验证这些片段在细胞内的表达和定位。首先,构建的3个重组质粒p GEX-4T-1-B-LB-Sβ1、p GEX-4T-1-B-LB-β1和p GEX-4T-1-B-LB-β2TC均能单一表达目的蛋白B-LB-Sβ1、B-LB-β1和B-LB-β2TC,并被纯化。其次,在共表达和pull-down中,B-LB-Sβ1和B-LB-β1能够与Ii形成复合物,而B-LB-β2TC不能与Ii结合,因为免疫印迹的结果表明,特异性抗体能识别在poll-down中被结合的这两个目的蛋白。最后在真核表达系统中,也证实B-LB-Sβ1、B-LB-β1能保持B-L分子在293T细胞的浆膜系统定位的功能,而B-LB-β2TC却丧失了该定位功能。本研究结果首次提供了Ⅱ类分子结合Ii的活性片段的证据。
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