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Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活的作用及机制研究

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Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活...

作者：李碧榕吉林大学

学位级别：硕士

目的:牙周炎是由菌群失调引发的慢性炎症,是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。其临床主要表现为牙龈炎症和牙槽骨的吸收。牙周炎的发生发展过程是由多种炎症因子进行调控的,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal p... 详细信息

目的:牙周炎是由菌群失调引发的慢性炎症,是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。其临床主要表现为牙龈炎症和牙槽骨的吸收。牙周炎的发生发展过程是由多种炎症因子进行调控的,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体是存在于胞质的多蛋白复合体。它参与了机体的固有免疫反应,活化白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)等促炎因子并介导细胞焦亡,在维持免疫平衡与调控炎症进程等方面具有重要作用。但在牙周炎中,NLRP3炎症小体激活的具体机制尚不清晰。本实验中分别抑制Caspase-11和Pannexin1的表达,检测其下游NLRP3炎症小体激活情况,探讨Caspase-11在牙周炎中激活NLRP3炎症小体的机制。方法:1、使用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)-脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。2、应用si-Casp-11转染方法,敲低Raw264.7中Caspase-11的表达,采用Western blot方法,检测Caspase-11蛋白表达,评价转染效率。使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。3、应用si-Panx1转染方法,敲低Raw264.7中Pannexin1的表达,采用Western blot方法,检测Pannexin1蛋白表达,评价转染效率。使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。4、应用CBX和AZD9056分别抑制Pannexin1通道和P2X7受体的功能,使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。5、应用正畸丝结扎法构建大鼠牙周炎模型,使用Micro-CT扫描动物样本,检测牙槽骨吸收情况,并对骨参数进行分析。应用局部注射CBX或AZD9056的方式治疗实验组大鼠,采用Western blot和组织学染色方法,检测大鼠牙龈组织中Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。结果:1、Western Blot结果显示,LPS组Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达较对照组均显著上调。2、Western Blot结果显示,si-Casp-11组Caspase-11的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,P.gingivalis-LPS诱导的Pannexin1通道开放和NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。3、Western Blot结果显示,si-Panx1组Pannexin1的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,P.gingivalis-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。4、Western Blot结果显示,CBX组和AZD9056组P.gingivalis-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。5、Micro-CT分析显示,大鼠上颌第一磨牙存在较为严重的骨吸收现象,釉牙骨质界到牙槽嵴顶(Cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离是对照组的3.0倍。Western blot和组织学染色结果显示,两抑制剂组大鼠牙龈组织中Caspase-1和IL-1β结论:1、Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活;2、Pannexin1通道通过释放胞外ATP介导牙周炎中NLRP3炎症小体激活。

关键词：牙周炎脂多糖 Caspase-11 Pannexin1 NLRP3炎症小体

Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活的作用及机制研究

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Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活...

七氟烷介导发育期大鼠海马Pannexin1蛋白上调产生中枢神经毒性的研究

中华口腔医学会口腔种植专业委员会第14次全国口腔种植学...

作者：李碧榕李尊泰孟维艳吉林大学口腔医院口腔种植科吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室

目的:牙周炎是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。牙周炎的发展过程是由多种炎症因子进行调控的。NLRP3炎症小体是存在于胞质的多蛋白复合体,参与了机体的固有免疫反应,活化IL-1β和IL-18等促炎因子并介导细胞焦亡,在维持免疫平衡与调控... 详细信息

目的:牙周炎是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。牙周炎的发展过程是由多种炎症因子进行调控的。NLRP3炎症小体是存在于胞质的多蛋白复合体,参与了机体的固有免疫反应,活化IL-1β和IL-18等促炎因子并介导细胞焦亡,在维持免疫平衡与调控炎症进程等方面具有重要作用。本研究分别抑制Caspase-11和Pannexin1的表达,检测其下游NLRP3炎症小体激活情况,探讨Caspase-11在牙周炎中激活NLRP3炎症小体的机制。方法:在体外研究中,应用Western blot分析脂多糖刺激Raw264.7巨噬细胞中Caspase-11的表达、Pannexin1通道的开放以及NLRP3炎症小体的激活情况,研究siRNA分别抑制Caspase-11和Pannexin1的作用。在体外和体内研究中,应用组织学染色方法和Western blot分析Pannexin1和P2X7受体在牙周炎模型中的作用和关系。结果:Western blot结果表明,牙周炎时巨噬细胞中Caspase-11的表达、Pannexin1通道的开放以及NLRP3炎症小体的激活均有所增加,siRNA抑制Caspase-11后,Pannexin1通道的开放以及NLRP3炎症小体的激活减少,siRNA抑制Pannexin1后,caspase-11的表达没有明显改变而NLRP3炎症小体的激活减少。抑制Pannexin1和P2X7受体后均使NLRP3炎症小体的激活减少。结论:Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活,减少Caspase-11表达抑制了Pannexin1通道的开放。Pannexin1通道通过释放胞外ATP介导牙周炎中NLRP3炎症小体激活、炎症细胞因子的释放。

关键词：牙周炎脂多糖 Caspase-11 Pannexin1 NLRP3炎症小体

来源： cnki会议评论

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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2023年第8期 0172-0176页

作者：毕聪杰刘智张文慧王迪大连市中心医院麻醉科辽宁大连116033

探讨发育期大鼠吸入七氟烷后Pannexin1(Panx1)蛋白表达及对成年后学习记忆功能的影响。方法出生后7天Sprague-Dawley(SD)大鼠(P7)32只,分为对照组(Ctrl组,n=8)和七氟烷组(Sevo组,n=8),暴露于3%七氟烷4小时,采用Western blotting方法检... 详细信息

探讨发育期大鼠吸入七氟烷后Pannexin1(Panx1)蛋白表达及对成年后学习记忆功能的影响。方法出生后7天Sprague-Dawley(SD)大鼠(P7)32只,分为对照组(Ctrl组,n=8)和七氟烷组(Sevo组,n=8),暴露于3%七氟烷4小时,采用Western blotting方法检测P7大鼠海马Panx1、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X (Bax)和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的水平。另16只大鼠在P28到P33进行Morris水迷宫测试,以评估学习记忆功能。结果与对照组大鼠相比,P7大鼠暴露于3%七氟醚4小时后,海马中Panx1、Bax和Caspase-3蛋白表达增加(P1蛋白表达,增加凋亡,并影响成年后的学习记忆能力。

关键词：七氟烷 Pannexin1 学习记忆

Pannexin1在脓毒症所致急性肾损伤发生发展中的作用及机制研究

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Pannexin1在脓毒症所致急性肾损伤发生发展中的作用及机制研究

作者：黄冠文上海交通大学

学位级别：硕士

背景:脓毒症所致的急性肾损伤（sepsis-induced acute kidney injury,SI-AKI）是导致医院获得性急性肾损伤的第五大常见原因,其死亡率高,预后差,经济负担重,成为了医学界的研究热点和社会广泛关注的公共卫生问题。SI-AKI发病机制复杂,... 详细信息

背景:脓毒症所致的急性肾损伤（sepsis-induced acute kidney injury,SI-AKI）是导致医院获得性急性肾损伤的第五大常见原因,其死亡率高,预后差,经济负担重,成为了医学界的研究热点和社会广泛关注的公共卫生问题。SI-AKI发病机制复杂,细胞凋亡和炎症反应在SI-AKI的发生发展中起了重要作用。Pannexin1（Panx1）是细胞膜上的一类通道糖蛋白,在体内生理病理过程中起到重要作用,参与免疫反应、细胞损伤、细胞分化及肿瘤发生发展等过程。前期研究发现,Panx1在肾缺血再灌注损伤（kidney ischemia/reperfusion injury,IRI）和顺铂所致急性肾损伤（cisplatin-induced acute kidney injury,CIA）中表达上升,抑制Panx1对IRI和CIA有肾保护作用。然而,Panx1在SI-AKI中的作用尚不明确。因此,本研究拟通过体内、体外和临床研究初步探讨Panx1在SI-AKI中的作用及其与凋亡和炎症的关系。方法:第一部分:1)C57BL/6N小鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立SI-AKI模型。小鼠随机分成3组:Con组,10mg/kg LPS组和20mg/kg LPS组,检测小鼠血清肌酐和尿素氮水平,苏木素伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和过碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色观察肾组织病理损伤情况,q PCR检测小鼠肾脏AKI标志物肾脏损伤因子（kidney injury molecule,KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的m RNA水平以确定LPS腹腔注射的最佳浓度。q PCR、Western blot和免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测SI-AKI小鼠肾组织Panx1水平。采用Panx1抑制剂甘珀酸（Carbenoxolone,CBX）预处理小鼠,并将小鼠随机分成3组:Con组,LPS组和LPS+CBX组,检测各组小鼠肾功能水平和AKI标志物,观察肾组织病理损伤情况。2)回顾性收集2014年8月到2019年8月于我院进行肾活检并诊断为SI-AKI的患者,以肾活检结果为病变轻微的患者为对照组,收集其一般资料和临床数据,并采用IHC检测患者肾组织Panx1表达情况。第二部分:通过LPS刺激HK-2细胞建立SI-AKI的细胞模型。CCK8检测HK-2细胞经LPS不同浓度和时间诱导后的细胞活力,以确定LPS诱导的最佳浓度和时间。将HK-2细胞分为NC组、Si-Panx组、NC+LPS组和Si-Panx+LPS组。检测各组小鼠肾组织和HK-2细胞的凋亡水平、cleaved caspase-3、Bax和Bcl2蛋白表达水平。第三部分:q PCR和ELISA检测各组小鼠和HK-2细胞炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）,IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及抗炎因子IL-10水平,western blot检测NLRP3、cleaved caspase-1和activeIL-1β蛋白水平。IHC检测小鼠肾组织巨噬细胞浸润情况。结果:第一部分:1)和Con组相比,10mg/kg LPS组小鼠肾脏病理学改变显著,但血肌酐、尿素氮、肾脏KIM-1和NGAL m RNA水平上升不显著;20mg/kg LPS组小鼠肾脏病理学改变显著,血肌酐、尿素氮、肾脏KIM-1和NGAL m RNA水平显著升高。因此我们选择小鼠腹腔注射20mg/kg LPS构建SI-AKI小鼠模型。和Con组相比,LPS组小鼠肾脏Panx1 m RNA和蛋白表达水平显著升高,IHC显示Panx1主要分布于肾小管。CBX预处理改善了SI-AKI小鼠肾功能和病理损伤,降低了肾小管损伤评分指数、KIM-1和NGAL m RNA水平。2)入选3例SI-AKI患者和3例对照组患者。和对照组患者相比,SI-AKI患者肾脏Panx1表达升高,IL-1β、IL-6和TNF-α及抗炎因子IL-10水平上升。第二部分:和Con组小鼠相比,LPS组肾组织TUNEL阳性细胞数显著增加,凋亡指数显著升高,肾组织cleaved caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,Bcl2蛋白表达显著降低。CBX预处理显著降低了SI-AKI小鼠肾组织TUNEL阳性细胞数、凋亡指数、肾组织cleaved caspase-3和Bax,Bcl2蛋白表达回复。HK-2细胞在LPS 1000ng/ml诱导24h时细胞活力最低,即LPS诱导HK-2细胞的最佳条件为1000ng/ml诱导24h。和NC组HK-2细胞相比

关键词：脓毒症急性肾损伤 Pannexin1 炎症 NLRP3 凋亡

愈痫灵方对戊四氮致痫大鼠Pannexin1炎症信号通路蛋白及炎症因子表达的影响

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现代中西医结合杂志 2024年第6期33卷 757-761,777页

作者：李广丽李振光李智雄王净净田明琴陈琼琼李浩月杨湘怡湖南中医药大学湖南长沙410036 湖南省脑科医院(湖南省第二人民医院) 湖南长沙410021

目的探讨愈痫灵方对戊四氮致痫大鼠Pannexin1(PANX1)炎症信号通路及炎症因子表达的影响。方法取健康雄性SD大鼠80只,随机选择10只作为对照组,腹腔注射生理盐水;其余70只腹腔注射戊四氮建立癫痫模型。将造模成功的40只大鼠随机分为模型... 详细信息

目的探讨愈痫灵方对戊四氮致痫大鼠Pannexin1(PANX1)炎症信号通路及炎症因子表达的影响。方法取健康雄性SD大鼠80只,随机选择10只作为对照组,腹腔注射生理盐水;其余70只腹腔注射戊四氮建立癫痫模型。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组、愈痫灵方组、丙磺舒组和丙戊酸钠组,每组10只。愈痫灵方组给予3.24 g/(kg·d)愈痫灵方灌胃,丙磺舒组给予13.3 mg/(kg·d)丙磺舒灌胃,丙戊酸钠组给予31.9 mg/(kg·d)丙戊酸钠灌胃,模型组和对照组给予同等体积蒸馏水灌胃,均1次/d,连续灌胃14 d。末次灌胃结束后取大鼠颞叶内侧海马,采用Western blot法检测海马组织中PANX1、白细胞介素-1β(IL-1β)、p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达情况;取腹主动脉血,采用ELISA法检测血清IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)、核因子κB(NF-κB)水平。结果模型组海马组织中PANX1、IL-1β、p65、p-p65蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均1蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均0.05);愈痫灵方组及丙戊酸钠组海马组织中IL-1β、p65、p-p65蛋白相对表达量均明显低于模型组和丙磺舒组(P均1β、IL-6、NF-κB水平均明显高于对照组(P均1β水平均明显低于模型组和丙磺舒组(P均0.05);愈痫灵方组血清IL-6、NF-κB水平均明显高于丙戊酸钠组(P均0.05)。结论愈痫灵方可以降低癫痫大鼠海马组织中PANX1炎症信号通路蛋白的表达,减少下游炎症因子IL-1β、p65、p-p65的产生,这可能是其抗癫痫的作用机制之一。

关键词：癫痫愈痫灵方 Pannexin1 炎症因子戊四氮大鼠

Pannexin1通道在睾丸癌细胞侵袭迁移中的作用及可能机制

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Pannexin1通道在睾丸癌细胞侵袭迁移中的作用及可能机制

作者：刘号峰蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的:1.观察Pannexin1通道蛋白在睾丸细胞中的表达。2.明确Pannexin1通道对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的作用及可能机制。方法:1.Western blotting法检测睾丸间质细胞TM3和睾丸癌I-10细胞中Pannexin1蛋白表达。2.Pannexin1通道抑制剂甘珀酸... 详细信息

目的:1.观察Pannexin1通道蛋白在睾丸细胞中的表达。2.明确Pannexin1通道对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的作用及可能机制。方法:1.Western blotting法检测睾丸间质细胞TM3和睾丸癌I-10细胞中Pannexin1蛋白表达。2.Pannexin1通道抑制剂甘珀酸(CBX)和丙磺舒(PBN)作用睾丸癌I-10细胞后,使用实时荧光传递法和细胞外ATP检测法检测CBX和PBN对Pannexin1通道功能的抑制作用;transwell法和细胞划痕法检测CBX和PBN对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的抑制作用;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。3.分子生物学沉默(sh RNA)和过表达Pannexin1(m Panx-1)后,使用实时荧光传递法和细胞外ATP检测法检测sh RNA和m Panx-1分别抑制和增强Pannexin1通道功能;transwell法和细胞划痕法检测sh RNA对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的抑制作用和m Panx-1增强睾丸癌I-10侵袭迁移能力;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。4.在sh RNA和m Panx-1稳转细胞株中,使用U0126(p-ERK抑制剂)抑制p-ERK的表达后,transwell法和细胞划痕法检测U0126对sh RNA和m Panx-1稳转细胞株细胞侵袭迁移的抑制作用;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。结果:1.与睾丸间质细胞TM3相比,睾丸癌细胞中Pannexin1蛋白表达量显著增多。Western blotting结果显示,相比睾丸间质细胞TM3,睾丸癌细胞Tcam-2、MLTC-1以及I-10中Pannexin1表达量明显增高(PPannexin1通道后,Pannexin1通道功能下降。实时荧光传递实验发现:与control组相比,使用Pannexin1通道抑制剂CBX和PBN后,细胞荧光传递能力明显下降(荧光传递强度反应Pannexin1通道强弱)(PPannexin1通道功能强)发现,与control组相比,使用CBX和PBN抑制Pannexin1通道后,细胞外ATP含量明显降低(PPannexin1通道后,睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力下降。Transwell和划痕结果表明:与Control组相比,CBX组和PBN组的迁移能力降低(P1可降低睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力。实时荧光传递实验发现:沉默Panx-1基因后,睾丸癌I-10细胞中Pannexin1通道功能变弱(P1后,睾丸癌细胞I-10侵袭迁移能力降低(P1增强睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力。实时荧光传递实验发现:过表达Panx-1基因后,睾丸癌I-10细胞中Pannexin1通道功能变强(P1后,睾丸癌细胞I-10侵袭迁移能力增强(P1细胞株中,m Panx-1增强睾丸癌细胞侵袭迁移能力,U0126(p-ERK抑制剂)能显著降低过表达株细胞侵袭迁能力。Transwell和划痕实验发现,在过表达Panx-1基因细胞株中,与NC组和m Panx-1组相比,U0126+m Panx-1组能显著抑制睾丸癌细胞侵袭迁移(P126+m Panx-1能显著抑制MMP-9和vimentin蛋白的表达,增强E-cadherin蛋白的表达(P1.Pannexin1通道蛋白在睾丸癌I-10细胞中表达量增加。2.Pannexin1通道促进睾丸癌I

关键词： Pannexin1 睾丸癌侵袭迁移 ERK1/2

Pannexin1离子通道的结构与功能研究进展

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生物化学与生物物理进展 2021年第10期48卷 1137-1145页

作者：郑翔叶升赵伟陈渊浙江农林大学林业与生物技术学院杭州311300 天津大学生命科学学院天津300072 浙江省特色中药资源保护与创新利用重点实验室杭州311300

Pannexin1(PANX1)是一个可以通透包括ATP在内的多种化合物以及离子的离子通道蛋白.它可以在细胞凋亡、炎症等多种生理现象中起到重要的作用,被认为是一个具有潜力的治疗靶点.若要将其当作治疗靶点,需要对其作为离子通道的特性有较为深... 详细信息

Pannexin1(PANX1)是一个可以通透包括ATP在内的多种化合物以及离子的离子通道蛋白.它可以在细胞凋亡、炎症等多种生理现象中起到重要的作用,被认为是一个具有潜力的治疗靶点.若要将其当作治疗靶点,需要对其作为离子通道的特性有较为深刻的认识.此前针对该离子通道的研究有诸多限制,随着近几年冷冻电镜技术的发展,对离子通道的研究发展到了一个新的阶段.受益于冷冻电镜技术,PANX1蛋白的结构被解析出来,包括激活机制、离子通路以及小分子抑制剂的阻断机制在内的多个问题有了阶段性的解答.本文旨在从结构生物学的角度,介绍该离子通道的一些基础特性,并分析目前该蛋白质研究上所遇到的问题,为将来的工作提出重点研究目标.

关键词： Pannexin1 冷冻电镜结构生物学

小鼠脑梗死后脑组织Pannexin1与HDAC9的表达改变及其意义

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小鼠脑梗死后脑组织Pannexin1与HDAC9的表达改变及其意义

作者：麦汉滔南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的根据全球流行病学的调查,脑卒中（Cerebral Stroke）是导致人类死亡的第二大病因,其中缺血性脑卒中是脑血管病中最常见的一种类型,由于其高致残率与高死亡率等原因,脑卒中仍然对人类生命健康构成重大的威胁。现今缺血性... 详细信息

研究背景与目的根据全球流行病学的调查,脑卒中（Cerebral Stroke）是导致人类死亡的第二大病因,其中缺血性脑卒中是脑血管病中最常见的一种类型,由于其高致残率与高死亡率等原因,脑卒中仍然对人类生命健康构成重大的威胁。现今缺血性脑卒中的治疗手段十分有限,至今仍缺乏有效的临床治疗药物。深入研究缺血性脑卒中的发病机制以及寻找其潜在的治疗靶点是现在研究的热点。Pannexin1广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统中,主要位于细胞膜上,形成膜通道结构。已有研究发现基于Pannexin1的脑梗死治疗策略在部分动物实验中得到验证,但对于Pannexin1蛋白在脑梗死中的表达情况尚未有较深入研究。因此本课题通过小鼠脑缺血模型探讨Pannexin1表达的改变,希望为后续Pannexin1在脑梗死的作用与机制的研究提供新的理论依据。最近研究发现,表观遗传学机制组蛋白去乙酰化等在缺血性脑梗死的病理机制中也起到重要的作用。在动物脑梗死模型上多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACs Inhibitors）也被证实具有神经保护作用,HDACs家族具有多个亚型,部分亚型的作用与机制已被探讨,其中组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）在脑梗死中的作用尚未深入研究。因此,本课题通过观察HDAC9在脑梗死后表达的情况,探索其与脑梗死发生的关系,从而进一步了解HDAC9在缺血性脑卒中的相关机制。第一部分小鼠脑梗死后脑组织Pannexin1的表达改变及其意义目的:检测线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）后小鼠不同部位脑组织Pannexin1在卒中后不同时间点的表达情况,探讨Pannexin1与缺血性脑卒中的关系。方法:健康雄性C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组与模型组,模型组按照Koizumi’ s线栓法进行小鼠脑梗死模型的构建,假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。模型组根据术后不同时间（4h,8h,12h,1d,3d,7d and 14d）提取健侧与患侧脑组织。采用免疫荧光染色观察Pannexin1脑组织内分布位置,以及脑梗死后Pannexin1分别与MAP2和GFAP的关系,采用Western免疫印迹法与实时荧光定量PCR法检测各组不同部位（梗死侧/对侧皮层//假手术组皮层）Pannexin1的表达变化。结果:1.免疫荧光染色:梗死灶周围脑组织Pannexin1的荧光强度较其他部位明显增强。2.免疫荧光双标染色:Pannexin1与MAP2存在共定位,与GFAP不存在共定位表达。3.蛋白与mRNA表达检测:（1）小鼠梗死侧脑组织Pannexin1的表达比健侧大脑及对照组高,并具有统计学意义（P＜0.05）,mRNA与蛋白表达的情况相似。（2）脑梗死后4小时,Pannexin1的表达已出现上调,到梗死后3天达到高峰,而后逐步下降,到14天Pannexin1的表达仍高于对照组。（3）进一步检测pannexin蛋白家族另一亚型pannexin2表达情况:脑梗死后pannexin2蛋白并没有发生上调或下调。结论:1.脑梗死后Pannexin1表达的上调及随时间表达改变的情况,进一步说明Pannexin1与缺血性卒中密切相关。2.小鼠脑梗死后Pannexin1主要在神经元内表达,而非星形胶质细胞上。3.pannexin2蛋白可能不与Pannexin1协同参与脑梗死的病理过程。第二部分小鼠脑梗死后脑组织HDAC9的表达改变及其意义目的:检测线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）后小鼠不同部位脑组织HDCA9的表达及胞内分布变化,探讨HDAC9与缺血性脑卒中的关系。方法:健康雄性C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组与模型组,模型组按照Koizumi’ s线栓法进行小鼠脑梗死模型的构建,假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。采用免疫荧光染色观察HDAC9脑组织内分布位置与胞内分布变化,采用Western免疫印迹法与实时荧光定量PCR法检测各组不同部位（梗死侧/对侧皮层/MCAO组小脑/假手术组皮层/假手术组小脑）HDAC9的表达变化。结果:1.免疫荧光染色:（1）脑梗死后,梗死灶周围脑组织HDAC9的荧光强度较其他部位明显增强。（2）高倍镜下与假手术组对比,梗死灶周围HDAC9胞浆内表达增多,核内表达减少。2.蛋白与mRNA表达检测:与各组对比,梗死侧脑组织HDAC9表达显著升高,具有统计学差异（均P＜0.05）,蛋白与mRNA表达情况相一致。结论:HDAC9表达的上调以及细胞内表达的改变与缺血性卒中密切相关,可能参与其病理生理过程。

关键词：脑卒中 MCAO模型 Pannexin1 组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）

Pannexin1-P2X7途径介导Elabela及apelin亚型促兔体外血栓形成

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Pannexin1-P2X7途径介导Elabela及apelin亚型促兔体外血栓形成

作者：陈哲南华大学

学位级别：硕士

目的:Elabela及apelin为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体。apelin/APJ系统在心血管系统中发挥重要的作用如调节血压、增强心肌收缩、促进血管平滑肌细胞增殖和血管生成。本课题组前期研究发现Pannexin1-P2X7途径介导Elabela和apelin-12、... 详细信息

目的:Elabela及apelin为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体。apelin/APJ系统在心血管系统中发挥重要的作用如调节血压、增强心肌收缩、促进血管平滑肌细胞增殖和血管生成。本课题组前期研究发现Pannexin1-P2X7途径介导Elabela和apelin-12、-17、-32浓度依赖性促血小板聚集,而apelin-13抑制ADP诱导的血小板聚集。本课题延续前期研究,拟探讨Elabela和apelin各亚型对兔体外血栓形成的影响。深入探讨Pannexin1-P2X7是否介导Elabela和apelin各亚型对兔体外血栓形成的影响,自噬途径是否介导apelin-13抑制ADP诱导的兔体外血栓形成。课题从Pannexin1-P2X7及自噬途径视角揭示Elabela和apelin亚型与血栓形成之间的关系,可能对血栓性疾病提供新的理论基础和药物筛选靶标。方法:1.体外血栓检测仪分析兔体外血栓形成情况;2.HE染色观察血小板形态;3.ELASA检测血栓性疾病病人血浆中Elabela和apelin亚型浓度变化;结果:1.Elabela(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1.0μM)和apelin-12(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1.0μM、10μM)、-17(10μM、10μM、10μM、10μM)、-36(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1.0μM)均呈浓度依赖性促进兔体外血栓形成。而apelin-13对体外血栓形成无作用,但浓度依赖性抑制ADP诱导的兔体外血栓形成;2.APJ受体抑制剂F13A拮抗Elabela和apelin-12、-17、-36诱导的兔体外血栓形成,且APJ受体抑制剂F13A拮抗apelin-13对ADP诱导的兔体外血栓形成的抑制作用;3.Pannexin1抑制剂丙磺舒(Probenecid,Prb)、生胃酮(Carbenoxolone,Cbx)拮抗Elabela和apelin-12、-17、-36诱导的兔体外血栓形成,但其不能拮抗apelin-13对ADP诱导的兔体外血栓形成的抑制作用;4.P2X7抑制剂亮蓝(Brilliant blue G,BBG)拮抗Elabela和apelin-12、-17、-36诱导的兔体外血栓形成;5.自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa)能拮抗apelin-13对ADP诱导的兔体外血栓形成的抑制作用,但自噬抑制剂3MA不影响apelin-13的抑制作用;6.与正常体检人群相比,血栓性疾病病人血浆中Elabela和apelin-12,-17,-36的浓度降低,而apelin-13的浓度没有变化;7.Elabela和apelin-12、apelin-17、apelin-36诱导血小板活化,apelin-13抑制ADP诱导的血小板活化;结论:Elabela和apelin-12、-17、-36可通过Pannexin1-P2X7途径促进兔体外血栓形成,apelin-13通过自噬途径抑制ADP诱导的兔体外血栓形成。

关键词： Elabela Apelin-12 Apelin-13 Apelin-17 Apelin-36 APJ Pannexin1 P2X7 自噬血栓形成脑梗死心肌梗死