Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活的作用及机制研究

作     者：李碧榕 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孟维艳

授予年度：2023年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周炎 脂多糖 Caspase-11 Pannexin1 NLRP3炎症小体 

摘      要：目的:牙周炎是由菌群失调引发的慢性炎症,是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。其临床主要表现为牙龈炎症和牙槽骨的吸收。牙周炎的发生发展过程是由多种炎症因子进行调控的,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体是存在于胞质的多蛋白复合体。它参与了机体的固有免疫反应,活化白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)等促炎因子并介导细胞焦亡,在维持免疫平衡与调控炎症进程等方面具有重要作用。但在牙周炎中,NLRP3炎症小体激活的具体机制尚不清晰。本实验中分别抑制Caspase-11和Pannexin1的表达,检测其下游NLRP3炎症小体激活情况,探讨Caspase-11在牙周炎中激活NLRP3炎症小体的机制。方法:1、使用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)-脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。2、应用si-Casp-11转染方法,敲低Raw264.7中Caspase-11的表达,采用Western blot方法,检测Caspase-11蛋白表达,评价转染效率。使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。3、应用si-Panx1转染方法,敲低Raw264.7中Pannexin1的表达,采用Western blot方法,检测Pannexin1蛋白表达,评价转染效率。使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。4、应用CBX和AZD9056分别抑制Pannexin1通道和P2X7受体的功能,使用P.gingivalis-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。5、应用正畸丝结扎法构建大鼠牙周炎模型,使用Micro-CT扫描动物样本,检测牙槽骨吸收情况,并对骨参数进行分析。应用局部注射CBX或AZD9056的方式治疗实验组大鼠,采用Western blot和组织学染色方法,检测大鼠牙龈组织中Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。结果:1、Western Blot结果显示,LPS组Caspase-11、Pannexin1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达较对照组均显著上调。2、Western Blot结果显示,si-Casp-11组Caspase-11的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,P.gingivalis-LPS诱导的Pannexin1通道开放和NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。3、Western Blot结果显示,si-Panx1组Pannexin1的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,P.gingivalis-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。4、Western Blot结果显示,CBX组和AZD9056组P.gingivalis-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。5、Micro-CT分析显示,大鼠上颌第一磨牙存在较为严重的骨吸收现象,釉牙骨质界到牙槽嵴顶(Cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离是对照组的3.0倍。Western blot和组织学染色结果显示,两抑制剂组大鼠牙龈组织中Caspase-1和IL-1β结论:1、Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活;2、Pannexin1通道通过释放胞外ATP介导牙周炎中NLRP3炎症小体激活。