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Protective Effect of Silibinin on Lipopolysaccharide-Induced Endotoxemia by Inhibiting caspase-11-Dependent Cell Pyroptosis

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Chinese Journal of Integrative Medicine 2024年第10期30卷 917-926页

作者： OU Jin-ying LIU Shan-hong TANG Dong-kai SHI Ling-zhu YAN Li-jun HUANG Jing-yan ZOU Li-fang QUAN Jing-yu YOU Yan-ting CHEN Yu-yao YU Lin-zhong LU Zi-bin Third Level Research Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine School of Traditional Chinese MedicineSouthern Medical UniversityGuangzhou510515China Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Pharmaceutics Guangzhou510515China School of Traditional Chinese Medicine Southern Medical UniversityGuangzhou510515China

Objective:To explore the protective effect and the underlying mechanism of silibinin(SIB),one of the active compounds from Silybum marianum(L.)Gaertn in ***:Mouse peritoneal macrophage were isolated via intraperitoneally injection of BALB/c mice with thioglycolate *** viability was assessed using the cell counting kit-8,while cytotoxicity was determined through lactate dehydrogenase cytotoxicity *** protein expressions of interleukin(IL)-1α,IL-1β,and IL-18 were determined by enzyme-linked immunosorbent *** lipopolysaccharide(LPS)levels were measured by employing both the limulus amoebocyte lysate assay and flow ***,proximity ligation assay was employed for the LPS and caspase-11 *** were divided into 4 groups:the control,LPS,high-dose-SIB(100 mg/kg),and low-dose-SIB(100 mg/kg)groups(n=8).Zebrafish were divided into 4 groups:the control,LPS,high-dose-SIB(200μmol/L),and low-dose-SIB(100μmol/L)groups(n=30 for survival experiment and n=10 for gene expression analysis).The expression of caspase-11,gasdermin D(GSDMD),and N-GSDMD was determined by Western blot and the expressions of caspy2,gsdmeb,and IL-1βwere detected using quantitative real-time *** observation was performed through hematoxylineosin staining,and protein levels in bronchoalveolar lavage fluid were quantified using the bicinchoninicacid protein ***:SIB noticeably decreased caspase-11 and GSDMD-mediated pyroptosis and suppressed the secretion of IL-1α,IL-1β,and IL-18 induced by LPS(Pcaspase-11 and intracellular LPS(Pcaspase-11 and N-terminal fragments of GSDMD,inhibited the relative cytokines,prolonged the survival time,and up-regulated the survival rate in the endotoxemia models(P<0.05).Conclusions:SIB can inhibit pyroptosis in the LPS-mediated endotoxemia model,at l

关键词： silibinin caspase-11 endotoxemia pyroptosis inflammation

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Scutellarin inhibits caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages via regulating PKA signaling

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2021年第1期11卷 112-126页

作者： Jiezhou Ye Bo Zeng Meiyan Zhong Hongchun Li Lihui Xu Junxiang Shu Yaofeng Wang Fan Yang Chunsu Zhong Xunjia Ye Xianhui He Dongyun Ouyang Department of Immunobiology College of Life Science and TechnologyJinan UniversityGuangzhou 510632China Wuzhongpei Memorial Hospital of Shunde Foshan 528300China Department of Cell Biology College of Life Science and TechnologyJinan UniversityGuangzhou 510632China

Inflammatory caspase-11 senses and is activated by intracellular lipopolysaccharide(LPS)leading to pyroptosis that has critical role in defensing against bacterial infection,whereas its excess activation under pathogenic circumstances may cause various inflammatory ***,there are few known drugs that can control caspase-11 *** report here that scutellarin,a flavonoid from Erigeron breviscapus,acted as an inhibitor for caspase-11 activation in *** dosedependently inhibited intracellular LPS-induced release of caspase-11 p26(indicative of caspase-11 activation)and generation of N-terminal fragment of gasdermin D(GSDMD-NT),leading to reduced *** also suppressed the activation of non-canonical nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3(NLRP3)inflammasome as evidenced by reduced apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD(ASC)speck formation and decreased interleukin-1 beta(IL-1 b)and caspase-1 p10 secretion,whereas the NLRP3-specific inhibitor MCC950 only inhibited IL-1 b and caspase-1 p10 release and ASC speck formation but not *** also suppressed LPS-induced caspase-11 activation and pyroptosis in RAW 264.7 cells lacking ASC ***,scutellarin treatment increased Ser/Thr phosphorylation of caspase-11 at protein kinase A(PKA)-specific sites,and its inhibitory action on caspase-11 activation was largely abrogated by PKAinhibitor H89 or by adenylyl cyclase inhibitor MDL12330 ***,our data indicate that scutellarin inhibited caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages at least partly via regulating the PKA signaling pathway.

关键词： caspase-11 Macrophages Gasdermin D Pyroptosis Scutellarin PKA signaling

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LPS的胞内受体caspase-11的研究进展

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生物化学与生物物理进展 2018年第3期45卷 289-296页

作者：罗炳生刘靖华南方医科大学基础医学院广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

以往的研究认为,TLR4是内毒素(LPS)的胞膜受体.新近的研究发现含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11(caspase-11,Casp11)可能在胞内LPS的识别中发挥关键作用.caspase-11与胞内LPS结合后被激活.活化的Casp-11一方面剪切下游gasdermin D分子... 详细信息

以往的研究认为,TLR4是内毒素(LPS)的胞膜受体.新近的研究发现含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11(caspase-11,Casp11)可能在胞内LPS的识别中发挥关键作用.caspase-11与胞内LPS结合后被激活.活化的Casp-11一方面剪切下游gasdermin D分子进而介导细胞焦亡(pyroptosis),另一方面激活NLRP3/ASC-Casp-1通路,使细胞分泌促炎因子IL-1β和IL-18等.Casp-11还能通过促进吞噬体和溶酶体融合,增强细胞对革兰氏阴性菌的杀灭.在严重内毒素血症过程中,由于Casp-11过度活化,大量细胞发生焦亡,致使大量胞内促炎介质被释放到胞外,导致机体出现难以调控的炎症反应,最终发展成内毒素休克.Casp-11是内毒素休克发生的关键分子.本文对Casp-11在LPS的识别、活化及效应方面的最新进展进行综述.

关键词： caspase-11 LPS 革兰氏阴性菌内毒素休克细菌清除

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caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中的作用及其机制研究

Caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中的作用及其机制研究

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作者：刘梦琛中南大学

学位级别：硕士

目的:探索caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中的作用及其机制。方法:(1)为了检测CFA诱导的炎性疼痛小鼠的机械疼痛痛阈与脊髓caspase-11表达的关系,将2月龄野生型C57BL/6小鼠(WT)随机分为正常组和炎性疼痛组。正常组小鼠不做任何处理,炎... 详细信息

目的:探索caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中的作用及其机制。方法:(1)为了检测CFA诱导的炎性疼痛小鼠的机械疼痛痛阈与脊髓caspase-11表达的关系,将2月龄野生型C57BL/6小鼠(WT)随机分为正常组和炎性疼痛组。正常组小鼠不做任何处理,炎性疼痛组小鼠在右后肢足底注射20微升弗氏完全佐剂(CFA)。用Von-Frey细丝在注射CFA的前1天和注射后头7天检测两组小鼠右后肢足底的机械疼痛阈值。在CFA注射后第2天和第5天,用western blot和PCR检测两组小鼠右侧脊髓腰膨大caspase-11的表达水平。(2)为了探索caspase-11在不同炎性疼痛模型中的作用,将WT小鼠和caspase-11敲除小鼠(caspase-11KO)作为研究对象。通过在小鼠右后肢足底注射20微升CFA构建炎性疼痛模型,并于注射CFA前1天和注射后1-7天用Von-Frey细丝检测右后肢足底的机械疼痛阈值,并在注射CFA后第9天用高架十字迷宫检测小鼠的焦虑行为。另外通过在小鼠右后肢足底注射20微升5%的福尔马林构建另一种炎性疼痛模型,在注射后1小时内以每5分钟为单位记录小鼠舔或抖右后肢的时间。(3)为了探索caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中的作用机制,WT小鼠和caspase-11KO小鼠随机分为WT组、WT+CFA组、caspase-11KO组、caspase-11KO+CFA组。WT组、caspase-11KO组小鼠正常饲养,不做任何处理;WT+CFA组和caspase-11KO+CFA组小鼠分别在两种小鼠的右后肢足底注射20微升CFA。用Iba1免疫荧光观察小鼠右侧脊髓腰膨大后角中小胶质细胞的活化情况;用荧光定量PCR检测右侧脊髓腰膨大中IL-18、NLRP3、caspase-1的m RNA表达。结果:(1)与正常组相比,炎性疼痛组小鼠右后肢足底注射CFA后的7天内右后肢足底的机械疼痛痛阈显著降低(Pcaspase-11m RNA(Pcaspase-11KO小鼠右后肢足底注射CFA后第1-2天的右后肢足底痛阈无显著差异(P>0.05),但在注射后第3-6天足底痛阈显著升高(P0.05)。在福尔马林诱导的炎性疼痛模型中,WT小鼠和caspase-11KO小鼠右后肢足底注射福尔马林后1小时内舔和抖右后肢的时间无明显差异(P>0.05)。这些表明caspase-11敲除减轻了CFA诱导的炎性疼痛,但对于福尔马林诱导的炎性疼痛无明显作用。(3)与WT组小鼠相比,WT+CFA组小鼠在右后肢足底注射CFA后第2天和第5天其右侧脊髓腰膨大后角的小胶质细胞活化明显(Pcaspase-1m RNA(Pcaspase-11KO组小鼠比,caspase-11KO+CFA组小鼠在注射CFA后第2天右侧脊髓腰膨大后角小胶质细胞活化程度(P0.05),注射CFA后第2天和第5天右侧腰膨大中NLRP3和caspase-1m RNA的表达水平则无明显差异(P>0.05)。结论:caspase-11在CFA诱导的炎性疼痛中起重要作用,作用机制可能与抑制神经炎症的程度和持续时间有关。图3幅,表2个,参考文献57篇

关键词：疼痛神经炎症 caspase-11

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副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

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微生物学通报 2022年第12期49卷 5171-5183页

作者：李艳杨君翟少伦楚品品卞志标张昆丽李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心广东茂名525000

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体... 详细信息

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞,收集6、12和24 h细胞,RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;收集感染后48 h细胞,Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72 h细胞上清,ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平;不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24 h,ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株,收集OMVs感染后12、24和48 h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】caspase-11mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(Pcaspase-1 mRNA转录水平在感染后6、12和24 h显著高于对照组(Pcaspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达均明显升高。OMVs感染RAW264.7细胞后12、24、48和72 h,IL-1β表达量极显著高于对照组(Pcaspase-11沉默后,IL-1β水平在感染后12、24和48h显著低于未沉默组;caspase-11沉默组IL-18表达量在感染后24、48h均显著低于未沉默组(Pcaspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜囊泡 caspase-11 NLRP3炎性体 IL-1β IL-18

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caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活的作用及机制研究

Caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活...

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作者：李碧榕吉林大学

学位级别：硕士

目的:牙周炎是由菌群失调引发的慢性炎症,是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。其临床主要表现为牙龈炎症和牙槽骨的吸收。牙周炎的发生发展过程是由多种炎症因子进行调控的,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal p... 详细信息

目的:牙周炎是由菌群失调引发的慢性炎症,是目前导致牙齿缺失的主要原因之一。其临床主要表现为牙龈炎症和牙槽骨的吸收。牙周炎的发生发展过程是由多种炎症因子进行调控的,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体是存在于胞质的多蛋白复合体。它参与了机体的固有免疫反应,活化白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)等促炎因子并介导细胞焦亡,在维持免疫平衡与调控炎症进程等方面具有重要作用。但在牙周炎中,NLRP3炎症小体激活的具体机制尚不清晰。本实验中分别抑制caspase-11和Pannexin1的表达,检测其下游NLRP3炎症小体激活情况,探讨caspase-11在牙周炎中激活NLRP3炎症小体的机制。方法:1、使用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,***)-脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测caspase-11、Pannexin1、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达。2、应用si-Casp-11转染方法,敲低Raw264.7中caspase-11的表达,采用Western blot方法,检测caspase-11蛋白表达,评价转染效率。使用***-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测caspase-11、Pannexin1、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达。3、应用si-Panx1转染方法,敲低Raw264.7中Pannexin1的表达,采用Western blot方法,检测Pannexin1蛋白表达,评价转染效率。使用***-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测caspase-11、Pannexin1、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达。4、应用CBX和AZD9056分别抑制Pannexin1通道和P2X7受体的功能,使用***-LPS预处理Raw264.7,采用Western blot方法,检测caspase-1和IL-1β的蛋白表达。5、应用正畸丝结扎法构建大鼠牙周炎模型,使用Micro-CT扫描动物样本,检测牙槽骨吸收情况,并对骨参数进行分析。应用局部注射CBX或AZD9056的方式治疗实验组大鼠,采用Western blot和组织学染色方法,检测大鼠牙龈组织中caspase-1和IL-1β的蛋白表达。结果:1、Western Blot结果显示,LPS组caspase-11、Pannexin1、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达较对照组均显著上调。2、Western Blot结果显示,si-Casp-11组caspase-11的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,***-LPS诱导的Pannexin1通道开放和NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。3、Western Blot结果显示,si-Panx1组Pannexin1的蛋白表达较阴性对照组下降了约60%,***-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。4、Western Blot结果显示,CBX组和AZD9056组***-LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。5、Micro-CT分析显示,大鼠上颌第一磨牙存在较为严重的骨吸收现象,釉牙骨质界到牙槽嵴顶(Cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离是对照组的3.0倍。Western blot和组织学染色结果显示,两抑制剂组大鼠牙龈组织中caspase-1和IL-1β结论:1、caspase-11通过开放Pannexin1通道促进牙周炎中NLRP3炎症小体激活;2、Pannexin1通道通过释放胞外ATP介导牙周炎中NLRP3炎症小体激活。

关键词：牙周炎脂多糖 caspase-11 Pannexin1 NLRP3炎症小体

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复方中药对肺纤维化小鼠肺组织COL-Ⅰ、caspase-11及细胞因子水平的影响

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中华中医药学刊 2015年第9期33卷 2127-2129页

作者：张琳琳李利丹李玉虎上海中医药大学上海201203

目的:观查中药复方对肺纤维化小鼠肺组织COL-Ⅰ、caspase-11及细胞因子IL-1β、TNF-α、LPS表达水平的影响,探讨复方中药对肺纤维化的治疗作用及可能的作用机制。方法:清洁级昆明小鼠48只随机分为六组(每组8只):空白对照组、模型组、中... 详细信息

目的:观查中药复方对肺纤维化小鼠肺组织COL-Ⅰ、caspase-11及细胞因子IL-1β、TNF-α、LPS表达水平的影响,探讨复方中药对肺纤维化的治疗作用及可能的作用机制。方法:清洁级昆明小鼠48只随机分为六组(每组8只):空白对照组、模型组、中药复方一组(丹参组)、中药复方二组(复方组)。除空白对照组外,其余各组小鼠给予2.5 mg/kg LPS生理盐水溶液(1 mg/m L)滴鼻诱导肺纤维模型,造模后3 d,药物组每天分别给予相应药物剂量灌胃,21天后,全部处死,取小鼠肺部组织,ELISA方法检测IL-1β、TNF-α、LPS表达含量,Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白COL-Ⅰ、蛋白酶caspase-Ⅱ含量表达。结果:Western blot检测结果:与空白组相比,各组COL-Ⅰ的灰度值均升高,但差异无统计学意义(P>0.05),与模型组相比,各药物组COL-Ⅰ的灰度值均有下降趋势,其中醇提组较显著(P>0.05);caspase-11的表达,模型组与各药物组间均高于空白组,其中模型组与丹参组升高比较明显(Pcaspase-11的表达均有下降趋势,其中复方组的表达较显著,差异有统计学意义(Pcaspase-11作为最新研究发现参与炎症反应、细胞凋亡的蛋白,本次实验中证明,caspase-11参与肺纤维化的形成,且中药复方组与醇提组能够有效降低其表达量,其可能为减轻肺纤维化形成的机制。

关键词：肺纤维化复方中药 IL-1β TNF-α LPS caspase-11

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ALDH2通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡减轻脓毒血症心肌损伤

ALDH2通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡减轻脓毒血症...

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作者：梁欢蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的构建小鼠脓毒血症盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)模型及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的H9C2心肌细胞损伤模型,探讨线粒体乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是否通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡对脓毒血症性心肌损伤发挥保护作用。方法一、动物实验SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、CLP组、CLP+Alda-1(ALDH2特异性激动剂)组、Sham+二甲基亚砜(DMSO,Alda-1药物溶剂)组。CLP组小鼠术前12h禁食不禁水;CLP+Alda-1组小鼠术前1h腹腔注射10mg/kg Alda-1;DMSO+Sham组腹腔注射10mg/kg DMSO。造模24h后,超声心动图评估小鼠心功能变化;HE染色观察心肌组织病理变化;透射电镜观察心肌超微结构变化;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)检测心肌组织炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)的表达变化;蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测心肌caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化;免疫共沉淀(coimmunoprecipitation,CO-IP)探讨ALDH2与非经典焦亡相关各蛋白的关系。二、细胞实验利用腺病毒感染心肌细胞,构建ALDH2基因稳定过表达的细胞株;以LPS浓度为300μg/ml干预心肌细胞建立脓毒血症心肌损伤模型。心肌细胞随机分为4组:正常对照组(normal group,NG)、LPS损伤组(LPS)、LPS+ALDH2基因过表达组(LPS+ALDH2-GFP)、LPS+病毒空载对照组(LPS+GFP)。分组干预心肌细胞24h后,CCK-8法测定细胞活性;分光光度法检测细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平;免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)与蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测各组caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化。结果一、动物实验与Sham组相比,CLP组小鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短缩分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)、每搏输出量(stroke volume,SV)均明显降低(Pcaspase-11(Pcaspase-11(Pcaspase-11蛋白未被检测到。二、细胞实验与NG组相比,LPS组心肌细胞活性明显上升(Pcaspase-11(Pcaspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE(Pcaspase-11(P<0.05)、GSDMD(P<0.01)、HM

关键词：脓毒血症乙醛脱氢酶2 caspase-11 gasdermin D 非经典途径细胞焦亡

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CCK-8降低LPS诱导的小鼠单核细胞RAW264.7 CHOP/caspase-11/caspase-1的表达

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基础医学与临床 2015年第2期35卷 178-182页

作者：刘威段林许光明于峰张晓静宋宁河北省胸科医院骨科河北石家庄050041 河北医科大学第二医院呼吸内科河北石家庄050000 河北医科大学基础医学院法医学系河北石家庄050017

目的探讨CCK-8对LPS激活RAW264.7细胞CHOP/caspase-11/caspase-1信号通路的影响。方法用LPS和(或)CCK-8和(或)CCK-8的1受体阻滞剂孵育RAW 264.7细胞,用Western blot法检测CHOP、caspase-11蛋白表达,用试剂盒检测caspase-1活性,用ELISA技术检测细胞培养上清中IL-1β水平。结果与对照组相比,LPS组CHOP、caspase-11表达水平均显著升高(Pcaspase-11表达升高(Pcaspase-1活性变化、IL-1β含量变化趋势均与CHOP、caspase-11表达水平变化趋势一致(Pcaspase-11/caspase-1表达,减少LPS诱导IL-1β的生成,发挥抗炎作用。

关键词：胆囊收缩素脂多糖 C/EBP同源蛋白 caspase-11 caspase-1

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甲基苯丙胺诱导多巴胺能神经元凋亡过程中caspase-11作用机制的研究

甲基苯丙胺诱导多巴胺能神经元凋亡过程中caspase-11作用机制的研...

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作者：黄伟业南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),是一种极容易上瘾的精神类药物,又称去氧麻黄碱,具有苯环结构,与儿茶酚胺类递质结构极其相似,易溶于水及酒精,其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH作为一种新型毒品,由于其... 详细信息

研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),是一种极容易上瘾的精神类药物,又称去氧麻黄碱,具有苯环结构,与儿茶酚胺类递质结构极其相似,易溶于水及酒精,其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH作为一种新型毒品,由于其合成技术简单、容易获得等原因,已成为世界上流行最快、滥用最为广泛的中枢兴奋剂之一。同时METH长期滥用可引起各类刑事犯罪,给社会的治安带来极大危害。因此,对METH的毒性及其防治的研究已成为世界面临的重大课题和研究热点。METH作为一种拟交感胺类兴奋剂,其药理特性主要包括中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感神经能效应等。流行病学调查总结了大量的临床资料得出,METH可引起心、脑、肺、肝、肾等体内重要实质器官的损害。而在对众多器官损伤来上,其对中枢神经系统的毒性可给予人体带来严重的危害。随着研究的深入,其对中枢系统的损耗主要导致大脑黑质、纹状体、海马皮质多部位损伤,动物实验还发现可致动物大脑多巴胺能及五羟色胺能末梢损伤,包括纹状体内多巴胺(DA)含量下降,多巴胺转运体(DAT)降低,酪氨酸羟化酶(TH)活性减少,5-HT及代谢产物的耗竭,单胺囊泡转运体2 (VMAT-2)及多巴胺摄取位点缺失,导致神经元、轴索损伤,神经细胞凋亡。截至现在,METH的神经毒性机制尚未得到准确的阐明。而总结过往众多的研究结果,显示多种机制和通路参与了METH的神经毒性,包括：①多巴胺系统的紊乱导致氧化应激损伤;②谷氨酸的兴奋性作用导致Ca2+超载和细胞稳态破坏;③线粒体损伤及功能障碍;④诱导神经元凋亡等。本实验室前一阶段的研究中,PC12细胞作为细胞模型,给予METH处理后利用基因芯片技术检测凋亡相关基因的变化情况,其中caspase-11基因信号增强,并在后续Q-PCR预实验中得到了验证。作为caspase家族的一员,caspase-11在细胞凋亡、炎症和细胞迁移都扮演着重要的角色。有国外学者研究发现MPTP引起的多巴胺能神经元凋亡而引起的帕金森病,caspase-11在其中发挥着重要的作用。这跟本课题组前期的研究探索发现的METH可以引起多巴胺水平失调而出现帕金森症状可能存在相类似途径。本课题拟采用体内与体外两种实验方式对METH诱导的caspase-11表达变化进行定量分析,体内实验模型主要采用亚急性METH中毒的大鼠模型。而体外细胞模型包括PC 12细胞和SH-SY5Y细胞。除了进行定量的分析外,再通过设计特异的小干扰RNA片段以及使用caspase-11抑制剂对目的蛋白表达进行阻断,同时探究caspae-11表达变化对凋亡Maker基因,如caspase-3表达变化的影响。并通过功能学实验,如流式细胞计数,TUNEL染色,Hoechst染色等探索caspase-11的表达变化是否对METH引起细胞凋亡率也发生变化。另一方面,体内实验将选取富含多巴胺能胞体的中脑区域进行实验,首先检测caspase-11的表达变化情况以及凋亡Maker基因的表达变化情况,再通过立体定位技术定向显微注射重组病毒至大鼠中脑,从而获得特定区域caspase-11抑制大鼠模型;再给予METH刺激后,分离中脑区域,检测caspase-11的表达变化,以及检测Maker基因是否随着caspase-11的表达变化而变化。综上技术路线,探讨caspase-11发挥的作用机制,初步阐明caspase-11在METH引起的神经毒性损伤中的发挥的作用,为METH神经毒性损伤的预防和治疗提供理论基础和新的用药研究方向。目的：通过体内动物模型实验和体外两种细胞模型的实验,通过分子生物学技术联合基因沉默表达的相关技术来反复验证caspase-11以及凋亡maker基因在METH诱导后的表达变化情况,以及caspase-11与凋亡maker基因间的相互关系;并且通过功能学实验,检测caspase-11的表达变化对细胞的凋亡的影响。最终将初步阐明caspase-11在METH神经毒性损伤中的发挥的作用,为METH神经毒性损伤的预防和治疗提供一定的理论基础和新的用药研究方向。方法：1. caspase-11在METH处理的PC12细胞和SH-SY5Y细胞的表达情况及对caspase-11基因的沉默对细胞凋亡的影响(1) CCK8法测定不同浓度的METH处理后PC12细胞和SH-SY5Y细胞的LC25,LC50。(2) Q-PCR检测小干扰RNA转染后PC12细胞caspase-11基因的表达变化。(3) Western-blot检测给予不同处理后细胞内蛋白表达变化。(4) TUNEL染色、Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪分析给予细胞不同处理后凋亡率变化。2. caspase-11在亚急性METH中毒大鼠模型中

关键词：甲基苯丙胺 caspase-11 神经毒性凋亡多巴胺

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