Pannexin1在脓毒症所致急性肾损伤发生发展中的作用及机制研究

作     者：黄冠文 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王玲

授予年度：2020年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：脓毒症 急性肾损伤 Pannexin1 炎症 NLRP3 凋亡 

摘      要：背景:脓毒症所致的急性肾损伤（sepsis-induced acute kidney injury,SI-AKI）是导致医院获得性急性肾损伤的第五大常见原因,其死亡率高,预后差,经济负担重,成为了医学界的研究热点和社会广泛关注的公共卫生问题。SI-AKI发病机制复杂,细胞凋亡和炎症反应在SI-AKI的发生发展中起了重要作用。Pannexin1（Panx1）是细胞膜上的一类通道糖蛋白,在体内生理病理过程中起到重要作用,参与免疫反应、细胞损伤、细胞分化及肿瘤发生发展等过程。前期研究发现,Panx1在肾缺血再灌注损伤（kidney ischemia/reperfusion injury,IRI）和顺铂所致急性肾损伤（cisplatin-induced acute kidney injury,CIA）中表达上升,抑制Panx1对IRI和CIA有肾保护作用。然而,Panx1在SI-AKI中的作用尚不明确。因此,本研究拟通过体内、体外和临床研究初步探讨Panx1在SI-AKI中的作用及其与凋亡和炎症的关系。方法:第一部分:1)C57BL/6N小鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立SI-AKI模型。小鼠随机分成3组:Con组,10mg/kg LPS组和20mg/kg LPS组,检测小鼠血清肌酐和尿素氮水平,苏木素伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和过碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色观察肾组织病理损伤情况,q PCR检测小鼠肾脏AKI标志物肾脏损伤因子（kidney injury molecule,KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的m RNA水平以确定LPS腹腔注射的最佳浓度。q PCR、Western blot和免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测SI-AKI小鼠肾组织Panx1水平。采用Panx1抑制剂甘珀酸（Carbenoxolone,CBX）预处理小鼠,并将小鼠随机分成3组:Con组,LPS组和LPS+CBX组,检测各组小鼠肾功能水平和AKI标志物,观察肾组织病理损伤情况。2)回顾性收集2014年8月到2019年8月于我院进行肾活检并诊断为SI-AKI的患者,以肾活检结果为病变轻微的患者为对照组,收集其一般资料和临床数据,并采用IHC检测患者肾组织Panx1表达情况。第二部分:通过LPS刺激HK-2细胞建立SI-AKI的细胞模型。CCK8检测HK-2细胞经LPS不同浓度和时间诱导后的细胞活力,以确定LPS诱导的最佳浓度和时间。将HK-2细胞分为NC组、Si-Panx组、NC+LPS组和Si-Panx+LPS组。检测各组小鼠肾组织和HK-2细胞的凋亡水平、cleaved caspase-3、Bax和Bcl2蛋白表达水平。第三部分:q PCR和ELISA检测各组小鼠和HK-2细胞炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）,IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及抗炎因子IL-10水平,western blot检测NLRP3、cleaved caspase-1和activeIL-1β蛋白水平。IHC检测小鼠肾组织巨噬细胞浸润情况。结果:第一部分:1)和Con组相比,10mg/kg LPS组小鼠肾脏病理学改变显著,但血肌酐、尿素氮、肾脏KIM-1和NGAL m RNA水平上升不显著;20mg/kg LPS组小鼠肾脏病理学改变显著,血肌酐、尿素氮、肾脏KIM-1和NGAL m RNA水平显著升高。因此我们选择小鼠腹腔注射20mg/kg LPS构建SI-AKI小鼠模型。和Con组相比,LPS组小鼠肾脏Panx1 m RNA和蛋白表达水平显著升高,IHC显示Panx1主要分布于肾小管。CBX预处理改善了SI-AKI小鼠肾功能和病理损伤,降低了肾小管损伤评分指数、KIM-1和NGAL m RNA水平。2)入选3例SI-AKI患者和3例对照组患者。和对照组患者相比,SI-AKI患者肾脏Panx1表达升高,IL-1β、IL-6和TNF-α及抗炎因子IL-10水平上升。第二部分:和Con组小鼠相比,LPS组肾组织TUNEL阳性细胞数显著增加,凋亡指数显著升高,肾组织cleaved caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,Bcl2蛋白表达显著降低。CBX预处理显著降低了SI-AKI小鼠肾组织TUNEL阳性细胞数、凋亡指数、肾组织cleaved caspase-3和Bax,Bcl2蛋白表达回复。HK-2细胞在LPS 1000ng/ml诱导24h时细胞活力最低,即LPS诱导HK-2细胞的最佳条件为1000ng/ml诱导24h。和NC组HK-2细胞相比,LPS+NC组TUNEL阳性细胞数、凋亡指数、cleaved caspase-3和Bax蛋白水平显著升高,Bcl2蛋白显著表达降低。si RNA敲低Panx1表达后,TUNEL阳性细胞数、凋亡指数、cleaved caspase-3和Bax蛋白表达显著降低,Bcl2表达回复。第三部分:和Con组小鼠相比,LPS组小鼠血清及肾组织IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平显著上升;肾组织NLRP3炎症小体活化增加,NLRP3、cleaved caspase-1和活化的IL-1β蛋白表达水平显著上升;肾组织巨噬细胞浸润增加。CBX预处理显著降低了SI-AKI小鼠血清和肾组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平,IL-10水平下降,但组间差异未达到统计学意义;肾组织NLRP3炎症小体活化减少,NLRP3、cleaved caspase-1和活化的IL-1β蛋白表达水平显著下降;肾组织巨噬细胞浸润减少,但组间差异未达到统计学意义。和NC组HK-2细胞相比,LPS+NC组IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10 m RNA水平显著上升;NLRP3炎症小体活化增加,NLRP3、cleaved caspase-1和活化的IL-1β蛋白表达水平显著上升。si RNA敲低Panx1表达后,IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10 m RNA水平显著下降;NLRP3、cleaved caspase-1和活化的IL-1β蛋白表达水平显著下降。结论:Panx1在SI-AKI中表达升高,抑制Panx1可通过减少细胞凋亡,同时减少NLRP3炎症体激活和巨噬细胞浸润进而减轻SI-AKI的炎症反应,从而改善SI-AKI肾功能及减轻肾损伤。这些结果表明,抑制Panx1可能是SI-AKI的一种新的潜在治疗方法。