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在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

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中国人兽共患病杂志 1999年第4期15卷 13-16页

作者：郭军庆金宁一毛春生郭志儒尹凤阁殷震解放军农牧大学研究所病毒室河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南农业大学牧医工程学院

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能，制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原，将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建... 详细信息

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能，制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原，将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，其产物为３０ｋＤａ的ｓ１０－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组Ｐ２４蛋白均抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ—１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性，对研究开发ＡＩＤＳ诊断试剂和基因工程疫苗具有重要意义。

关键词： p24蛋白大肠杆菌 HIV-1 艾滋病

慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

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生物技术进展 2023年第3期13卷 457-464页

作者：刘超张玉柯刘华星汉德(上海)生物医药有限公司上海200120

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足,为解决上述问题,采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体,其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELIS... 详细信息

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足,为解决上述问题,采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体,其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA实验中的包被抗体与检测抗体的最佳工作浓度。对该方法进行了标准曲线线性范围、定量下限、准确度、精密度、特异性等的考察。取本公司自主研发生产的6个批次的慢病毒载体样品进行p24蛋白定量检测和放置稳定性来考察方法的适用性。实验结果显示,双抗夹心ELISA方法中包被抗体和生物素标记检测抗体的最优工作浓度分别为0.8μg·mL^(-1)和0.005μg·mL^(-1),方法在1.25~80.00 ng·mL^(-1)浓度区间有最佳线性,相关系数r2>0.95。批内和批间检测高、中、低质控品的回收率在80%~120%之间,变异系数均小于10.0%,定量检测下限为1.25 ng·mL^(-1)。同一种慢病毒载体6批次的p24蛋白含量检测结果均在30%偏差范围内,4批次样本放置8 h的稳定性检测结果偏差均在10%范围内。对双抗体夹心ELISA法进行了优化开发和全面验证,旨在提升慢病毒载体p24蛋白含量的定量检测水平,以及为慢病毒载体工艺开发、质量控制和批次之间质量的一致性研究提供重要的数据支撑和理论依据。

关键词：慢病毒载体 ELISA p24蛋白

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HIV感染早期病毒p24蛋白的检测

生物技术通讯 2006年第1期17卷 68-69页

作者：王慧娟皮国华谷淑燕中国疾病控制中心病毒病预防控制所应急技术中心北京100052

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双... 详细信息

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。

关键词：人类免疫缺陷病毒早期诊断双抗体夹心法 p24蛋白

HIV衣壳蛋白p24在临床检测中的研究进展

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中外医疗 2009年第31期28卷 21-22,24页

作者：肖艳芬广西中医学院广西南宁530001

本文就HIV衣壳蛋白p24的生物学特性、免疫反应、检测手段、临床应用及疫苗研究进展等方面进行了阐述,分析了p24蛋白在对HIV研究中的作用及其优缺点。

关键词： HIV p24蛋白临床检测

HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

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中国病毒学 2000年第2期15卷 116-121页

作者：童贻刚杜勇徐静李敬云鲁晏希鲍作义王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IpTG诱导高效表达 ,经SDS pAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一... 详细信息

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IpTG诱导高效表达 ,经SDS pAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白。

关键词： HIV-1 p24蛋白基因表达大肠杆菌诊断试剂

HIV-1感染骨髓造血细胞致血小板显著减少为首发症状一例

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中华医学杂志 2020年第36期100卷 2875-2876页

作者：孙黎飞范荣军吴强强田丽萍张燕张永红齐鲁医药学院公共卫生与检验学院淄博255300 解放军960医院淄博院区血液肿瘤实验室淄博255300 解放军960医院淄博院区输血科淄博255300

本文报道1例以严重血小板减少为首发症状,伴有中性粒细胞逐渐下降、感染和肝功能损害为主要临床表现的1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染中期(临床分期Ⅱ期)患者的诊疗经过。显示检测骨髓造血细胞表面HIV-1核心蛋白p24表达,可作为HIV-1感染... 详细信息

本文报道1例以严重血小板减少为首发症状,伴有中性粒细胞逐渐下降、感染和肝功能损害为主要临床表现的1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染中期(临床分期Ⅱ期)患者的诊疗经过。显示检测骨髓造血细胞表面HIV-1核心蛋白p24表达,可作为HIV-1感染窗口期的一种确诊手段。

关键词：人免疫缺陷病毒感染艾滋病 p24蛋白骨髓血细胞中性粒细胞过氧化物酶

适于HIV-1 p24抗原检测试剂的单抗制备与筛选

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中国人兽共患病学报 2007年第6期23卷 527-531页

作者：郭永利陈毅歆黄德党罗海峰葛胜祥程通张军夏宁邵厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室福建省医学分子病毒学研究中心厦门361005

目的制备抗HIV-1p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1p24抗原检测试剂。方法以基因工程原核重组抗原HIV-1p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRp标记后,利用双... 详细信息

目的制备抗HIV-1p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1p24抗原检测试剂。方法以基因工程原核重组抗原HIV-1p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRp标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测p24蛋白的最佳配伍单抗以期建立HIV-1p24抗原检测试剂。结果成功筛选到16株稳定分泌抗HIV-1p24单抗的杂交瘤细胞株,并从中筛选出最佳单抗配伍组合“16G12+2F2b-HRp”,该组合对p24蛋白的检测灵敏度为20pg/mL,对感染性克隆pNL4-3表达的HIV病毒培养上清检测呈阳性,对100份HIV阴性人血清无非特异性反应,显示出良好的检测灵敏度和特异性。结论本研究初步成功地建立了HIV-1p24抗原的检测试剂,并为最终建立HIV第四代诊断试剂(HIV Ag/Ab Assay)奠定了坚实的基础。

关键词： HIV-1 p24蛋白单克隆抗体夹心ELISA

抗HIVp24单链抗体的基因构建及序列测定

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上海免疫学杂志 1999年第1期19卷 8-11,20页

作者：魏云林和绍清李琦涵龚春梅路虹傅家忠中国医学科学院中国协和医科大学医学生物研究所

应用重组噬菌体抗体系统，从经过ＨＩＶ全蛋白裂解物及ｐ２４免疫过的鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建出组合单链抗体（ＳｃＦｖ）ｃＤＮＡ文库。ｃＤＮＡ文库克隆到噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，转化大肠杆菌ＴＧ１，得到２５×１０７个氨... 详细信息

应用重组噬菌体抗体系统，从经过ＨＩＶ全蛋白裂解物及ｐ２４免疫过的鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建出组合单链抗体（ＳｃＦｖ）ｃＤＮＡ文库。ｃＤＮＡ文库克隆到噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，转化大肠杆菌ＴＧ１，得到２５×１０７个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现，用ｐ２４蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行两轮亲和富集获得一株特异性好的抗ｐ２４的噬菌体单链抗体。经ＥＬＩＳＡ鉴定，该噬菌体呈ｐ２４结合ＥＬＩＳＡ阳性的滴度小于１０７ｐｆｕ／ｍｌ。并对ＳｃＦｖ进行了序列分析，对今后的应用奠定了基础。

关键词：单链抗体噬菌体抗体库 p24蛋白基因构建

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基于GLuc新型抗体检测技术的建立

基于GLuc新型抗体检测技术的建立

作者：马同辉吉林大学

学位级别：硕士

Gaussia荧光素酶(GLuc)是分离于海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)的新型荧光素酶。该荧光素酶能够催化腔肠素发出475nm的荧光。是目前己知的几种荧光素酶(Firefly Luciferase、Renilla Luciferase、Copepod Luciferase等)中,分子量最小的荧光素酶(约19.9KD),但却是目前发光强度最强的荧光素酶,因而在检测中具有广阔的应用前景。 GBV-C病毒(庚型肝炎病毒)是1995年从非甲-戊型肝炎病人体内,获得的新型病毒。起初,由于该病毒从未知病因的肝炎病人体内获得,因而认为其导致肝炎。但经过多年大量的流行病调查,发现该病毒在健康人中也有很大比例的分布,美国约2%-5%的健康人感染该病毒,但没有肝炎症状。最近,更是有大量实验证实该病毒复制的起始位置并不在肝脏,并通过体外实验证实该病毒可以在pBMC细胞中复制。但到目前为止,该病毒的具体复制起点仍然不清楚。且尚没有发现任何确切的疾病与该病毒相关,但大量的实验证实,GBV-C病毒具有-定的拮抗HIV病毒的作用,更是有实验证实,GBV-C的E2蛋白具有多种抗HIV的机制,NS3蛋白和NS5a蛋白以及抗GBV-C E2蛋白的抗体也有抗HIV的作用。 HIV病毒自1981年在美国发现以来,己造成全球超过1200万人死亡,并导致至少3000万人被感染,严重威胁着人类的健康。然而到目前为止,尚无针对艾滋病的有效治愈方法,被寄予厚望的艾滋病疫苗,却由于HIV病毒本身独具的特点,而屡遭挫折。目前,针对上述两种病毒的检测主要依靠ELISA方法进行。对于GBV-C的检测,主要以检测抗GBV-C E2蛋白的抗体作为GBV-C阳性的重要依据,而GBV-C E2蛋白是GBV-C病毒的一种包膜蛋白,具有三个糖基化位点,有实验证明血清中的E2抗体不识别原核表达的E2蛋白,据推测血清中的E2抗体只识别E2的空间表位。而原核表达的E2蛋白,未进行正确的修饰,不具有正确的空间构象。而目前常用的检测抗E2抗体的抗原E2蛋白均是由真核表达的,虽然具有了正确的构象,能够进行检测。但真核表达系统蛋白的纯化需要耗费大量的时间和成本,不利于检测的开展。本实验采用GLuc分别与GBV-C的E2蛋白以及HIV的p24蛋白融合表达,构建酶标E2蛋白和酶标p24蛋白。由于GLuc能够经高尔基体分泌表达,这样就可以直接对GBV-C E2蛋白进行糖基化,而p24蛋白无糖基化位点,不会被糖基化。而且,酶标蛋白分泌到上清中,可以吸取细胞培养上清直接应用于检测,省去了纯化等复杂的步骤。本论文利用能够吸附IgG抗体的sproteinA免疫磁珠对血清中的抗体进行吸附,然后加入上述酶标蛋白对血清中的抗体进行检测,通过实验成功检测到了GBV-C阳性血清和HIV阳性血清,且阳性血清和阴性血清的荧光值有很大差异。通过上述方法建立了基于GLuc的抗GBV-C E2抗体和抗HIV p24抗体的检测方法,该方法相对于目前常规的ELISA,省去了蛋白纯化等复杂步骤,有利于检测方法的迅速建立,对于建立突发传染性疾病的检测方法具有一定的借鉴意义

关键词：庚型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒 Gaussia荧光素酶 E2蛋白 p24蛋白