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btk及nfκb抑制剂对急淋小鼠疾病转归的影响及其作用机制的探讨

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Btk及NFκB抑制剂对急淋小鼠疾病转归的影响及其作用机制的探讨

作者：张欣南京医科大学

学位级别：硕士

目的:通过观察btk及nfκb抑制剂对急性b淋巴细胞白血病-NOD/SCID(bALL-NOD/SCID)模型小鼠疾病转归及生存期的影响,研究其可能的作用机制,探讨btk及nfκb抑制剂靶向治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的可行性及临床意义。方法:1.b-ALL-NOD/SCI... 详细信息

目的:通过观察btk及nfκb抑制剂对急性b淋巴细胞白血病-NOD/SCID(bALL-NOD/SCID)模型小鼠疾病转归及生存期的影响,研究其可能的作用机制,探讨btk及nfκb抑制剂靶向治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的可行性及临床意义。方法:1.b-ALL-NOD/SCID小鼠模型的构建:4周龄NOD/SCID小鼠尾静脉注射5×106个Nalm-6细胞(0.2ml),无菌层流柜中饲养。观察小鼠白血病发病情况;利用流式细胞术检测NOD/SCID小鼠移植Nalm-6细胞后外周血中CD10+CD19+细胞占有核细胞的比例。***-32765、bortezomib和Ara-c对b-ALL-NOD/SCID模型小鼠疾病转归的影响及其机制:将小鼠随机分为:空白组(未建模组)、b-ALL-NOD/SCID模型小鼠又分为:对照组(未加药组)、单药组(PCI-32765、bortezomib、Arac)、两药联用组(PCI-32765及bortezomib)及三药联用组(PCI-32765、bortezomib及Ara-c),于不同时间点(3天、7天、15天)加药,无菌层流柜中饲养,观察小鼠白血病发病情况、生存期、脾脏大小、重量变化及病理形态改变。于小鼠濒死前或死亡后即行解剖,留取骨髓细胞,瑞氏染色观察有无异常的白血病细胞;脾脏常规病理切片,观察异常白血病细胞在脾脏中的浸润情况;Western blot检测各组脾脏细胞btk、nfκb、凋亡蛋白caspase-3、抗凋亡蛋白bCL-XL、CIAP-1表达的变化。免疫组化检测脾脏细胞btk、nfκb蛋白的表达。结果:1.成功构建b-ALL-NOD/SCID模型小鼠:1.1 NOD/SCID小鼠移植后7天,流式细胞术检测外周血中CD10+CD19+细胞占有核细胞细胞的比例大于1%,提示小鼠生物学发病。1.2 NOD/SCID小鼠移植后15天,开始出现食欲减退,后肢瘫痪,弓背抬高等症状,提示临床发病。1.3白血病小鼠的平均生存期:(18.40±0.89)天。***、PCI-32765和Ara-c对b-ALL-NOD/SCID小鼠疾病转归的影响及其机制:2.1 NOD/SCID小鼠移植Nalm-6细胞3天后,单药应用bortezomib(1mg/kg)、PCI-32765(12.5mg/kg)、Ara-c(10mg/kg),各组小鼠生存期分别为(22.70±0.37天)、(22.30±0.52天)、(21.33±0.67天),bortezomib和PCI-32765两药联用组生存期为(28.00±0.60天),bortezomib、PCI-32765和Ara-c三药联用组生存期为(31.50±1.23天),与对照组小鼠生存期(18.67±0.42天)相比,生存期均显著延长(pbortezomib、PCI-32765小鼠生存期分别为(21.83±0.70天)、(21.67±0.42天),bortezomib和PCI-32765两药联用组生存期为(24.17±0.80天),与对照组小鼠生存期(18.40±0.40天)相比,生存期均显著延长(pbortezomib、PCI-32765后b-ALL-NOD/SCID小鼠的生存期比对照组有所延长,但并无统计学差异;单用Ara-c及联用bortezomib、PCI-32765和Ara-c生存期分别为(21.83±0.48天)、(23.67±0.71天),明显高于对照组(18.40±0.40天)及单药组(pbortezomib和PCI-32765,均可降低小鼠脾脏细胞btk及nfκb的表达,病理组织各组免疫组化平均累积光密度值(IOD)分别为btk:(73890.18±1911.34、74300.38±1516.14,36039.81±2894.98)vs对照组(120348.30±9881.02),(pnfκb:(73379.62±2121.27,74184.62±2208.24,33857.30±2789.34)vs对照组(109770.90±6849.65),(pblot检测示单药及联合用药组btk、nfκb及bCL-XL、CIAP-1表达水平下降(pb-ALL-NOD/SCID小鼠模型,生物学发病时间为7天,临床发病时间为15天。

关键词：急性b淋巴细胞白血病(b-ALL) btk nfκb PCI-32765 bortezomib Ara-c b-ALL-NOD/SCID小鼠

PI3K、Akt1、Akt2、nfκb在2型糖尿病骨质疏松大鼠肾组织中表达

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PI3K、Akt1、Akt2、NFκB在2型糖尿病骨质疏松大鼠肾组织中表达

作者：高岩河北医科大学

学位级别：硕士

目的：骨质疏松症（Osteoporosis，OP）作为一种“静悄悄的流行病”逐渐被认识。大量研究证实，1型糖尿病（Type1diabetic metabolism，T1DM）可导致骨质疏松症的发生，但2型糖尿病（Type2diabeticmetabolism，T2DM）与骨质疏松症的关... 详细信息

目的：骨质疏松症（Osteoporosis，OP）作为一种“静悄悄的流行病”逐渐被认识。大量研究证实，1型糖尿病（Type1diabetic metabolism，T1DM）可导致骨质疏松症的发生，但2型糖尿病（Type2diabeticmetabolism，T2DM）与骨质疏松症的关系尚不明确，有研究认为这可能与胰岛素信号通路有关。胰岛素信号通路的主要下游分子因子磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3K）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）表达下降在糖尿病和胰岛素抵抗发病机制中起重要作用。核因子κb（nfκb）信号通路可诱导破骨细胞分化、延长破骨细胞生存时间、促进骨吸收。研究发现PI3K-Akt信号通路通过调节nfκb、mTOR（mammaliantarget of rapamycin)等下游因子对细胞增殖、凋亡、葡萄糖转运等多种生物活动起调节作用。胰岛素抵抗主要发生在肾脏和骨骼肌，但在糖尿病晚期往往并发糖尿病肾病，同时肾脏通过调节成骨细胞、破骨细胞之间的平衡参与骨质疏松的发生、发展过程。2型糖尿病合并骨质疏松肾组织PI3K、Akt、nfκb表达如何，目前尚无报道，本研究旨在探讨PI3K、Akt、nfκb在2型糖尿病合并骨质疏松大鼠肾组织表达，为研究糖尿病骨质疏松的发病机制提供实验依据和理论基础。方法：100只健康雌性Wistar大鼠（2.5-3月龄）喂养1周后随机分为正常对照组（假手术组，NS组，N=24），单纯去卵巢组（NOVX组，N=26），2型糖尿病对照组（假手术组，DS组，N=24），2型糖尿病去卵巢组（DOVX组，N=26）。组间大鼠体重差异无统计学意义。去卵巢后4周、8周、12周各组随机选取5只大鼠，麻醉处死后分离肾脏，肾组织取材并提取肾组织总RNA，应用免疫组织化学方法检测NS组、NOVX组、DS组、DOVX组肾组织PI3K、Akt1、Akt2、nfκb蛋白水平的表达，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测PI3K、Akt1、Akt2、nfκb mRNA水平的表达。应用SPSS13.0统计软件处理实验数据，所有实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，计量资料多组间比较采用方差分析，P0.05）。2.2RT-PCR结果：去卵巢后4周时NOVX组明显高于NS组（P0.05）;去卵巢后12周DOVX组、DS组、NOVX组、NS组之间无显著差异（P>0.05）。3.2RT-PCR结果：去卵巢后4周时NOVX组低于NS组，但无统计学差异（P>0.05），DOVX组明显低于DS组（P0.05）;去卵巢后8周NOVX组明显高于NS组（P0.05），DS组明显低于NS组（P<0.05），DOVX组明显低于NOVX组（P<0.05）;去卵巢后12周NOVX组明显高于NS组（P<0.05），DOVX组明显低于DS组（P<0.05），DS组明显高于NS组（P<0.05），DOVX组明显低于NOVX组（P<0.05）。4肾脏Akt2表达水平4.1免疫组化结果：Akt2主要表达于

关键词： 2型糖尿病骨质疏松大鼠肾组织 PI3K Akt1 Akt2 nfκb

亚硒酸钠通过nfκb/PDK轴抑制糖酵解并促进肺癌细胞凋亡

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亚硒酸钠通过NFκB/PDK轴抑制糖酵解并促进肺癌细胞凋亡

作者：许晓安徽医科大学

学位级别：硕士

目的肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一。SSe具有一系列药理和生化特性,包括抗肿瘤,抗炎和抗氧化活性。然而,这些特性背后的具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨SSe在肺癌中的抗癌机制。方法用CCK-8法检测SSe处理后的肺癌A549,PC9和... 详细信息

目的肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一。SSe具有一系列药理和生化特性,包括抗肿瘤,抗炎和抗氧化活性。然而,这些特性背后的具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨SSe在肺癌中的抗癌机制。方法用CCK-8法检测SSe处理后的肺癌A549,PC9和LLC细胞的存活率。细胞划痕实验检测不同浓度SSe（0,7,15,30μmol/L）处理后的肺癌A549和PC9细胞的迁移。流式细胞术观察了不同浓度SSe（0,7,15,30μmol/L）处理后的肺癌A549,PC9和LLC细胞的凋亡。JC-1法检测了不同浓度SSe（0,7,15,30μmol/L）处理后的肺癌A549,PC9和LLC细胞的线粒体膜电位。q PCR实验检测不同浓度SSe（0,7,15,30μmol/L）和nfκb信号通路抑制剂（bAY11-7082）处理后的肺癌细胞的bcl-2,bax和细胞色素c以及PDK m RNA的变化水平。A549和PC9细胞经过不同浓度SSe,10μmol/LbAY11-7082和p65质粒处理后,用Western blot检测细胞中p-p65,p65,p-Iκbα,Iκbα,PDK,bcl-2,bax和细胞色素c的表达。检测经10μmol/LbAY11-7082和不同浓度SSe（0,7,15,30μmol/L）处理后的A549和PC9细胞的乳酸生成情况。免疫荧光（IHC）染色检测肺癌A549和PC9细胞经15μmol/LSSe和10μmol/LbAY11-7082处理后p65亚细胞定位的变化。采用免疫组化和HE染色检测SSe对鼠源肺癌LLC细胞体内移植瘤小鼠瘤体生长的抑制作用。Western blot检测小鼠瘤体中的p-p65,p65,p-Iκbα,Iκbα,PDK,bcl-2,bax和细胞色素c的表达。结果CCK-8,细胞划痕实验,Annexin V-FITC/PI凋亡及JC-1检测结果显示SSe对肺癌细胞生长和迁移起到抑制作用,对肺癌A549,PC9和LLC细胞的凋亡起到促进作用,并降低肺癌A549,PC9和LLC细胞的线粒体膜电位。q PCR实验结果表明SSe和bAY11-7082均能显著降低肺癌细胞bcl-2和PDK的表达,增加bax的表达。Western blot实验结果发现SSe和bAY11-7082均能显著降低肺癌细胞p-p65,p65,p-Iκbα,Iκbα,PDK和bcl-2的表达,增加bax和细胞色素c的表达,并抑制活化的p65从细胞质向细胞核的转位。将肺癌A549和PC9细胞进行p65的过表达,结果显示肺癌细胞bax和细胞色素c表达减少,p-p65,p65,p-Iκbα,Iκbα,PDK和bcl-2的表达增加。然而,当使用SSe进行干预以后,上述实验结果发生逆转。同时,体内研究发现SSe抑制小鼠瘤体生长。免疫组化结果显示,SSe抑制p-p65,p-Iκbα,PDK和bcl-2的表达,增加bax的表达。Western blot检测小鼠瘤体组织中凋亡标志因子和nfκb信号通路相关蛋白的变化发现,SSe抑制p-p65,p-Iκbα,PDK和bcl-2的表达,增加bax和细胞色素c的表达。结论本研究证明SSe通过抑制nfκb信号通路的活化,进而干扰PDK和凋亡因子的表达,抑制糖酵解,诱导肺癌细胞凋亡。这些结果突出了SSe作为临床治疗肺癌的药物的潜力。

关键词：亚硒酸钠 nfκb 丙酮酸脱氢酶激酶肺癌

Tan IIA对MCAO模型大鼠脑组织IKK-nfκb/Iκb通路的影响及抗凋亡作用

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Tan IIA对MCAO模型大鼠脑组织IKK-NFκB/IκB通路的影响及抗凋亡...

作者：杨凤真中南大学

学位级别：硕士

目的：研究缺血再灌注损伤的发病机理及寻找有效的治疗方法,探讨Tan ⅡA抗凋亡作用的可能机制。方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注(MCAO)模型,并结合Tan ⅡA不同时间和剂量腹腔注射治疗。TTC染色和HE染色观察缺血再灌注后脑... 详细信息

目的：研究缺血再灌注损伤的发病机理及寻找有效的治疗方法,探讨Tan ⅡA抗凋亡作用的可能机制。方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注(MCAO)模型,并结合Tan ⅡA不同时间和剂量腹腔注射治疗。TTC染色和HE染色观察缺血再灌注后脑组织形态学变化及Tan ⅡA治疗的影响。Western blot与免疫组化检测脑组织IKK及p-IKK、nfκb及p-nfκb和IKb及p-Iκb的表达水平,Tunel法检测凋亡细胞,分析缺血再灌注损伤后各分子表达变化和凋亡细胞数量以及Tan ⅡA治疗的影响。结果：***染色见正常组脑组织染色均匀,无梗死区。各模型组和治疗组均有不同程度的脑梗死,Tan ⅡA治疗能够减小脑梗死范围。***染色见正常对照组和假手术组组织分布正常,结构完整,其余各组有不同程度的组织病理学改变,特别是7d模型组,可见梗死区结构紊乱,间质水肿,炎性细胞浸润,有筛状坏死灶。Tan ⅡA治疗组缺血改变较模型组明显减轻,坏死范围缩小,细胞水肿减轻,以高剂量治疗组的改善作用最为明显。3. IKK、 nfκb与IKb在模型组和Tan IIA治疗组的表达水平显著高于正常对照组和假手术组(P0.05)。p-IKK、p-nfκb与p-Iκb的表达在模型组明显降低,与正常对照组和假手术组比较差异有统计学意义(Pnfκb/Iκb通路中活化分子的入核作用,影响下游凋亡相关基因的表达,进而发挥抗凋亡作用。含图12幅,表4个,参考文献35篇。

关键词：缺血再灌注 TanⅡA 凋亡 IKK nfκb Iκb

miR-20a调控nfκb对胃癌细胞耐药性的影响及相关机制的研究

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miR-20a调控NFκB对胃癌细胞耐药性的影响及相关机制的研究

作者：朱明霞南京医科大学

学位级别：硕士

目的：miRNA的异常表达与肿瘤耐药密切相关,nfκb持续激活也是肿瘤化疗耐药的重要机制。本研究旨在探索miR-20a对nfκb的作用关系,力图阐明miR-20a在调控胃癌耐药中的作用及内在机制。方法：运用实时聚合酶链式反应(real-time polymeras... 详细信息

目的：miRNA的异常表达与肿瘤耐药密切相关,nfκb持续激活也是肿瘤化疗耐药的重要机制。本研究旨在探索miR-20a对nfκb的作用关系,力图阐明miR-20a在调控胃癌耐药中的作用及内在机制。方法：运用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaetion, RT-PCR)检测miR-20a在胃癌患者血浆及组织样本、胃癌耐药患者血浆及组织样本、胃癌耐药细胞株中的表达水平。MTT药敏试验法检测各组细胞转染前后对化疗药物的敏感性。流式细胞术检测各组细胞转染后对化疗药物诱导凋亡的变化。免疫组化检测胃癌组织中nfKbIb表达水平。运用荧光素酶报告实验验证miR-20a的靶基因。Western blot检测各组细胞转染前后nfKbIb、核内p65、Livin及Survivin分子的表达变化。结果：与正常人群血浆及正常胃组织样本相比,miR-20a;在胃癌血浆、组织样本中表达水平明显增高。此外,miR-20a在胃癌耐药患者的血浆、组织样本和细胞株SGC7901/DDP中的表达水平呈进一步升高。在转染miR-20a抑制物组,胃癌顺铂耐药株SGC7901/DDP对顺铂的敏感性和顺铂诱导的凋亡增强;在转染miR-20a模拟物组,胃癌母代细胞株SGC7901对顺铂的敏感性和顺铂诱导的凋亡降低。miR-20a高表达伴随着nfKbIb (IκbP)蛋白低表达,核内p65、Livin和Survivin蛋白高表达。荧光素酶实验结果显示nfKbIb是miR-20a的靶基因。SGC7901/DDP细胞中敲低miR-20a表达能上调nfKbIb表达水平,下调核内p65、Livin和Survivin的表达水平。相反地,异位表达的miR-20a能显著下调SGC7901细胞株中nfKbIb的表达水平,上调核内p65、Livin和Survivin蛋白的表达。结论：miR-20a可通过靶向调控nfKbIb的表达,激活nfκb并影响下游抗凋亡蛋白Livin和Survivin的表达从而导致胃癌细胞对顺铂耐药。

关键词： miR-20a nfκb nfKbIb 顺铂耐药

枸杞多糖通过TLR4-nfκb/MAPK-blimp1通路促进小鼠树突状细胞成熟的研究

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枸杞多糖通过TLR4-NFκB/MAPK-Blimp1通路促进小鼠树突状细胞成熟...

作者：兰亚如宁夏医科大学

学位级别：硕士

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LbP)是中草药枸杞的主要活性成分。我们前期研究发现,LbP能促进树突状细胞(Dendritic cells,DC)的成熟,显示良好的佐剂效应。但其促进DC成熟的具体机制尚不清楚,本研究以TLR4为切入点,探讨其... 详细信息

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LbP)是中草药枸杞的主要活性成分。我们前期研究发现,LbP能促进树突状细胞(Dendritic cells,DC)的成熟,显示良好的佐剂效应。但其促进DC成熟的具体机制尚不清楚,本研究以TLR4为切入点,探讨其促进DC成熟的分子机制。目的:研究LbP促进DC成熟及亚型分化的分子机制,促进DC诱导T细胞分化的作用,为LbP开发为新型佐剂奠定基础。方法:1.体外实验观察LbP促进DC成熟的分子机制及其对DC亚型相关转录因子的影响无菌分离小鼠骨髓来源树突状细胞,用粒单核集落刺激因子(Granulocyte-mononuclear colony-stimulating factor,GM-CSF)和重组鼠白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)刺激,培养7天,此时为未成熟的DC,然后做如下研究:1.1分别用不同浓度的LbP刺激未成熟DC,以100 ng/mL LPS作为阳性对照:(1)LbP刺激24 h后,采用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86的表达;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清中IL-6、IL-4的水平。(2)LbP刺激30 min后,分别通过Taqman-PCR和蛋白质免疫印迹实验(Western blot,Wb)检测DC中TLR4通路中相关分子nfκb、p38、Erk、JNK、blimp1 mRNA和蛋白的表达水平。(3)LbP刺激30 min后,Taqman-PCR检测转录因子Irf4、Irf5、Irf8和batf3 mRNA表达水平;Wb检测转录因子IRF4、IRF5、IRF8蛋白表达水平。1.2分别阻断TLR4通路中关键分子TLR4、nfκb、p38、Erk、JNK和blimp-1,然后加入LbP刺激30 min,Taqman-PCR和Wb分别检测通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。1.3卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)预处理未成熟DC 2 h,再加入LbP刺激24 h,与CD4T淋巴细胞共培养,72 h后,FCM检测初始CD4T细胞分化为Th1、Th2、Treg、Tfh细胞的比例;ELISA检测细胞培养上清中IL-6、IL-4、Tnf、IFNγ的含量。2.体内实验研究LbP对DC中TLR4通路相关分子及DC亚型相关转录因子的影响分别用不同浓度LbP腹腔注射给C57bL/6小鼠,腹腔注射1 mg·kg·d LPS作为阳性对照,连续注射7天,Wb检测脾脏CD11cDC中TLR4、nfκb、p-nfκb、p38、p-p38、Erk1/2、p-Erk1/2、JNK、p-JNK、blimp1、IRF4、IRF5和IRF8蛋白的表达水平。结果1.体外实验观察LbP促进DC成熟的分子机制及其对DC亚型相关转录因子的影响1.1 LbP能促进DC表面CD11c、MHCII及共刺激分子CD80和CD86的表达,促进DC分泌IL-6和IL-4;增强DC中TLR4通路中关键分子nfκb、p38、Erk1、Erk2、JNK、blimp1及DC亚型相关转录因子IRF4、IRF5、IRF8、batf3 mRNA和磷酸化蛋白表达水平。1.2 TLR4通路中关键分子TLR4、nfκb、p38、Erk、JNK和blimp-1被阻断后,能有效干预LbP促进DC中TLR4通路中下游分子的表达。1.3 LbP能促进DC诱导初始CD4T细胞分化为Tfh细胞,增加细胞培养上清中IL-6、IL-4、Tnf的含量。2.体内实验研究LbP对DC中TLR4通路相关分子的影响小鼠体内实验显示,LbP增强小鼠脾脏CD11cDC TLR4通路中p-nfκb、p-p38、p-Erk1/2、blimp1分子和DC亚型相关分子IRF4、IRF8蛋白的表达。结论:LbP可通过TLR4-nfκb/Erk1/2-blimp1信号通路促进DC成熟,并诱导cDC1s和cDC2s的分化。LbP可促进DC诱导Tfh细胞的分化。

关键词：枸杞多糖树突状细胞 nfκb MAPK blimp1

苗药防感香囊通过TLR-MyD88-nfκb通路上调呼吸道免疫力的机制研究

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苗药防感香囊通过TLR-MyD88-NFκB通路上调呼吸道免疫力的机制研究

作者：朱名洁贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:以MyD88基因敲除小鼠和人正常肺上皮细胞(bEAS-2b)为模型,阐明苗药防感香囊(香囊)通过TLR-MyD88-nfκb通路提高呼吸道免疫力的机理。方法:1.体内研究:背景系为C57bL/6J雄性小鼠16只,SPF级,随机分为2组,每组8只:空白对照组(control... 详细信息

目的:以MyD88基因敲除小鼠和人正常肺上皮细胞(bEAS-2b)为模型,阐明苗药防感香囊(香囊)通过TLR-MyD88-nfκb通路提高呼吸道免疫力的机理。方法:1.体内研究:背景系为C57bL/6J雄性小鼠16只,SPF级,随机分为2组,每组8只:空白对照组(control组),香囊组(MFS组);MyD88基因敲除小鼠16只(购自南京大学实验动物中心),雄性,SPF级,随机分为2组,每组8只:MyD88基因敲除组(MyD88-KO组),MyD88基因敲除+香囊组(MyD88-KO+MFS组)。香囊干预组小鼠持续予以苗药防感香囊吸入处理30天(8:00am-8:00pm持续12小时吸入香囊,6天更换1次),30天后处死小鼠取材,检测血常规、肝肾功能等常规生化指标;采用hematoxylin-eosin染色观察各组小鼠肺组织病理形态变化;采用免疫组织化学、免疫荧光技术、Western blot方法、qRT-PCR等方法检测小鼠肺组织TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6的表达。2.体外研究:苗药防感香囊提取物由苗药防感香囊课题组前期试验提供,bEAS-2b细胞购自中国科学院昆明细胞库,CCK8法探索苗药防感香囊提取物作用于bEAS-2b细胞的最适浓度及时间。实验分为6组:空白对照组(Control组)、MyD88 siRNA组(MyD88 siRNA,MyD88 SI组)、MyD88 siRNA-阴性对照组(MyD88 siRNA negative control,MyD88 SI-NC组)、香囊刺激组(Sachet组)、MyD88 siRNA+香囊刺激组(MyD88 SI+Sachet组)、MyD88 siRNA-阴性对照+香囊刺激组(MyD88 SI-NC+Sachet组)。Western blot、qRT-PCR等方法检测各组bEAS-2b细胞MyD88、TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6的表达。结果:1.体内研究:(1)病理结果显示:空白对照组、香囊组、MyD88基因敲除组、MyD88基因敲除+香囊组小鼠肺组织轮廓完整,器官、支气管、毛细血管结构清晰、肺泡壁无明显渗出。香囊组小鼠部分标本肺泡腔内可见少量单核细胞、中性粒细胞浸润,Mikawa肺损伤评分进行统计,与空白对照组、香囊组相比,结果无统计学差异。(2)血常规:香囊组小鼠白细胞水平升高(P0.05)。(3)TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6的基因和蛋白表达情况:免疫组化、RT-PCR、Western blot检测结果提示,与空白对照组相比,香囊组(MFS组)小鼠肺组织上述分子的基因和蛋白表达水平升高(PbEAS-2b细胞的细胞活力,且TAK1、nfκb p65、Iκb、MyD88的mRNA的表达量最高(PbEAS-2b细胞MyD88、TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6基因和蛋白的表达显著下降(PbEAS-2b细胞MyD88、TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6的表达显著升高(PbEAS-2b细胞MyD88、TAK1、nfκb p65、Iκb、IL6基因和蛋白的表达稍增加(Pnfκb信号通路,并刺激下游细胞因子的释放起到免疫调节的作用。此外,苗药防感香囊也可能通过MyD88信号传导通路以外的其它途径刺激下游细胞因子的表达,起到调节呼吸道免疫力的作用。

关键词：苗药防感香囊固有免疫 MyD88 TAK1 nfκb IL6

丙烯酰胺对猪骨髓间充质干细胞nfκb通路的影响

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丙烯酰胺对猪骨髓间充质干细胞NFκB通路的影响

作者：陶晓莉华中农业大学

学位级别：硕士

骨髓间充质干细胞(bMMSCs)具有免疫调节功能,参与多种免疫反应,在体内具有优先迁移到受损组织器官发挥其修复功能的能力。现阶段的bMMSCs体外分离方法是建立在Friedenstein分离方法的基础上形成的。目前,由于bMMSCs的鉴定没有一种明确... 详细信息

骨髓间充质干细胞(bMMSCs)具有免疫调节功能,参与多种免疫反应,在体内具有优先迁移到受损组织器官发挥其修复功能的能力。现阶段的bMMSCs体外分离方法是建立在Friedenstein分离方法的基础上形成的。目前,由于bMMSCs的鉴定没有一种明确统一的体系,只能从几个方面综合分析来作为其鉴定的依据。丙烯酰胺(ACR)具有致癌性、遗传毒性以及神经毒性。本试验通过bMMSCs的分离鉴定,建立bMMSCs的体外培养体系,并探讨ACR对bMMSCs上ROS、Hsp27以及nfκb通路的影响,以期为ACR的作用机制研究提供一条新的线索。本文采用全骨髓贴壁法体外分离0-6月龄五指山小型猪bMMSCs,并利用CCK-8检测其增殖能力。bMMSCs的鉴定是通过细胞形态学分析、成脂成骨诱导分化潜能鉴定以及CD34/CD45/CD90/CD29/CD44细胞表面抗原的检测等几种指标综合分析。使用0.5mmM的ACR刺激bMMSCs 72 h,分别用ROS检测试剂盒检测ROS分泌量、ELISA试剂盒在蛋白水平检测Hsp27和IL-8表达量、实时定量PCR在mRNA水平上检测IL-8的表达量、双荧光素酶系统检测nfκb通路的激活状况,并用试剂盒检测ACR处理前后bMMSCs的细胞周期和凋亡状况。结果表明分离得到的五指山小型猪bMMSCs形态呈梭形或多角形,类似成纤维样细胞,细胞群体呈旋涡状生长。成脂、成骨诱导培养21d分别用油红O及茜素红染色均呈阳性。流式细胞仪检测显示,bMMSCs表达CD90、CD29及CD44,不表达造血干细胞标志性抗原CD34和白细胞标志性抗原CD45。0.5 mM的ACR刺激bMMSCs 72 h后检测其ROS、Hsp27、IL-8表达量均明显升高,双荧光素酶系统检测到nfκb通路被激活(PbMMSCs的细胞周期和凋亡未见明显变化。总之,本文摸索出五指山小型猪bMMSCs一套分离培养体系,通过形态学分析、分化潜能以及表面抗原三个方面检测,基本确定其为骨髓间充质干细胞。当0.5 mMACR刺激时,ROS、Hsp27及IL-8表达量均升高,细胞质中nfκb含量显著升高,说明nfκb通路可能被激活,而细胞凋亡和周期变化不明显。

关键词： bMMSCs 猪丙烯酰胺 Hsp27 nfκb

破骨细胞相关基因生物信息学分析及NFκB抑制剂JSH-23对破骨细胞...

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作者：韦灵锋广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:骨质疏松症在老年人和绝经后妇女当中很常见,其主要原因是骨吸收率大于骨形成率而造成骨密度下降,导致骨折易发生。破骨细胞是唯一具有骨吸收作用的细胞,通过抑制其形成或功能是治疗骨质疏松症的有效方法。本课题通过利... 详细信息

研究背景和目的:骨质疏松症在老年人和绝经后妇女当中很常见,其主要原因是骨吸收率大于骨形成率而造成骨密度下降,导致骨折易发生。破骨细胞是唯一具有骨吸收作用的细胞,通过抑制其形成或功能是治疗骨质疏松症的有效方法。本课题通过利用基因芯片筛选破骨细胞不同时期的差异基因并运用信息生物学进行分析,进而寻找可能基因蛋白靶点,然后使用对应抑制剂验证其对破骨细胞作用,从而为骨质疏松治疗提供新药物选择。方法:1.通过GEO数据库下载包含有破骨细胞不同时期的两组基因芯片数据。利用R语言Limma包筛选出破骨细胞形成和分化过程中的差异表达基因。运用DAVID在线分析软件对差异基因进行基因本体功能注释和KEEG通路分析。并通过STRING在线分析软件构建基因蛋白互作网络。使用Cytoscape的MCODE插件最终选出核心分子模块,确定核心基因。2.通过C57b/L6小鼠获得骨髓巨噬细胞,用30 ng/mL M-CSF诱导其成破骨前体细胞。用不同剂量浓度nfκb抑制剂JSH-23对其进行干预,5天后通过MTS实验评估JSH-23对破骨前体细胞增殖影响。通过使用30ng/mL M-CSF、l00ng/mL RANKL诱导骨髓单核巨噬细胞分化为成熟破骨细胞。在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,加入不同浓度JSH-23进行干预,5天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色,最后通过显微镜观察破骨细胞大小及数量。bMMS细胞在羟基磷灰石板培养并加入RANKL诱导,同时加入不同浓度JSH-23,最后再显微镜下观察羟基磷灰石涂层的吸收面积并用ImageJ软件分析。在RANKL诱导破骨分化的过程中,加入不同浓度的JSH-23,5天后提取细胞RNA,转录成cDNA,最后通过实时荧光定量PCR测定对应mRNA表达情况。单独使用RANKL或同时使用RANKL和JSH-23对破骨前体细胞进行诱导1小时,分别提取不同时间点细胞总蛋白,然后通过蛋白印迹实验检测蛋白表达变化。结果:1.通过两组破骨细胞分化过程的基因芯片进行分析,破骨细胞分化早期筛选出上调基因30个,下调基因19个;在破骨细胞分化中期筛选出上调基因4个。并构建蛋白相互作用网络,并选出差异基因中2个关键分子网络,分别是Mmp9、Src、Plau、Vegfc、Met、Mmp14和Traf1、nfkbie、nfkb2、Fos、Ctsk、Acp5。***-κb抑制剂JSH-23在10μM浓度下对破骨细胞前体细胞无毒性作用;JSH-23能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化及破骨细胞对羟基磷灰石溶解作用;JSH-23抑制RANKL诱导破骨细胞TRAP、CTSK、c-Fos和nfATc1基因mRNA表达量变化,并能抑制RANKL诱导破骨细胞分化过程中nfκb p65的蛋白磷酸化。结论:1.我们在破骨细胞分化两个时期中共筛查出53个差异基因,为进一步研究提供理论基础;***κb抑制剂JSH-23能抑制破骨细胞分化及骨吸收作用,并能影响相关基因及蛋白表达。

关键词：骨质疏松症破骨细胞生物信息学基因表达 nfκb JSH-23