丙烯酰胺对猪骨髓间充质干细胞NFκB通路的影响

作     者：陶晓莉 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：龙良启

授予年度：2011年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：BMMSCs 猪 丙烯酰胺 Hsp27 NFκB 

摘      要：骨髓间充质干细胞(BMMSCs)具有免疫调节功能,参与多种免疫反应,在体内具有优先迁移到受损组织器官发挥其修复功能的能力。现阶段的BMMSCs体外分离方法是建立在Friedenstein分离方法的基础上形成的。目前,由于BMMSCs的鉴定没有一种明确统一的体系,只能从几个方面综合分析来作为其鉴定的依据。丙烯酰胺(ACR)具有致癌性、遗传毒性以及神经毒性。本试验通过BMMSCs的分离鉴定,建立BMMSCs的体外培养体系,并探讨ACR对BMMSCs上ROS、Hsp27以及NFκB通路的影响,以期为ACR的作用机制研究提供一条新的线索。 本文采用全骨髓贴壁法体外分离0-6月龄五指山小型猪BMMSCs,并利用CCK-8检测其增殖能力。BMMSCs的鉴定是通过细胞形态学分析、成脂成骨诱导分化潜能鉴定以及CD34/CD45/CD90/CD29/CD44细胞表面抗原的检测等几种指标综合分析。使用0.5mmM的ACR刺激BMMSCs 72 h,分别用ROS检测试剂盒检测ROS分泌量、ELISA试剂盒在蛋白水平检测Hsp27和IL-8表达量、实时定量PCR在mRNA水平上检测IL-8的表达量、双荧光素酶系统检测NFκB通路的激活状况,并用试剂盒检测ACR处理前后BMMSCs的细胞周期和凋亡状况。 结果表明分离得到的五指山小型猪BMMSCs形态呈梭形或多角形,类似成纤维样细胞,细胞群体呈旋涡状生长。成脂、成骨诱导培养21d分别用油红O及茜素红染色均呈阳性。流式细胞仪检测显示,BMMSCs表达CD90、CD29及CD44,不表达造血干细胞标志性抗原CD34和白细胞标志性抗原CD45。0.5 mM的ACR刺激BMMSCs 72 h后检测其ROS、Hsp27、IL-8表达量均明显升高,双荧光素酶系统检测到NFκB通路被激活(P0.05)。然而,ACR刺激后BMMSCs的细胞周期和凋亡未见明显变化。 总之,本文摸索出五指山小型猪BMMSCs一套分离培养体系,通过形态学分析、分化潜能以及表面抗原三个方面检测,基本确定其为骨髓间充质干细胞。当0.5 mMACR刺激时,ROS、Hsp27及IL-8表达量均升高,细胞质中NFκB含量显著升高,说明NFκB通路可能被激活,而细胞凋亡和周期变化不明显。