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耻垢分枝杆菌中3-甾酮-δ1-脱氢酶对植物甾醇转化积累9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响

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应用与环境生物学报 2020年第4期26卷 739-746页

作者：李梦李雪梅冯进辉张瑞吴洽庆朱敦明马延和中国科学技术大学生命科学学院合肥230026 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-δ1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,KstD)在9α... 详细信息

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-δ1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,KstD)在9α-OH-AD的分解过程中起着重要的作用.耻垢分枝杆菌mc^2155(Mycobacterium smegmatismc^2155)菌株基因组中存在6个编码3-甾酮-δ1-脱氢酶基因,通过对这6个脱氢酶基因分别进行外源表达和活性测定,发现只有KstD1、KstD2和KstD3具有脱氢活力;使用CRISPR-Cas12a辅助重组技术成功构建了失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株,结果显示单独失活基因kstD1能够产生9α-OH-AD,但随着转化时间的延长,9α-OH-AD会降解,无法积累,同时失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株以5 g/L植物甾醇为底物时,转化14 d内9α-OH-AD能够稳定存在,产物浓度达到2.86 g/L.可见,耻垢分枝杆菌mc^2155中kstD1基因对9α-OH-AD积累起关键作用,随着转化的进行和产物的积累,kstD2和kstD3的作用逐渐显现,同时失活3个3-甾酮-δ1-脱氢酶有效提高了菌种生产9α-OH-AD的稳定性和产率,本研究结果可为构建9α-OH-AD生产菌种及产业化应用奠定基础.(图6表5参30)

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶 9α-羟基雄甾-4-烯-3 17-二酮植物甾醇生物转化

3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

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生物技术 2024年第2期34卷 158-164页

作者：董新林胡青何建新吕德强宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-δ1-脱氢酶（KstD）突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液；基于分光光度法原理，优化... 详细信息

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-δ1-脱氢酶（KstD）突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液；基于分光光度法原理，优化检测反应体系，利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库，表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮（4AD）和适量的酶液组成，温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-δ1-脱氢酶（KstD）突变体的高通量筛选方法，重复性变异系数在3%以下。

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶定点饱和突变高通量筛选半理性设计雄烯二酮酶标仪酶法脱氢突变体文库

简单节杆菌中3-甾酮-δ1-脱氢酶同工酶的底物偏好性及体内功能的初步分析

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简单节杆菌中3-甾酮-Δ1-脱氢酶同工酶的底物偏好性及体内功能的...

作者：程洪金天津科技大学

学位级别：硕士

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株,3-甾酮-δ1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,KsdD)是催化该反应的关键酶。课题组前期对工业菌株Arthrobacter simplex TCCC 11037进行了全基因组测序,生物信息学结果暗示,该菌株中5个基因的功能注释为KsdD(依次命名为KsdD1、KsdD2、KsdD3、KsdD4与KsdD5)。在此基础上,本文克隆得到系列ksdD基因,通过异源表达和过表达菌株的构建及其催化活性分析,对其底物偏好性和体内功能展开初步分析。生物信息学分析结果表明,简单节杆菌这5个KsdD之间的氨基酸序列一致性在35%～54%之间波动,与已知结构的红平红球菌SQ1中KsdD1之间的氨基酸序列一致性在36%～52%之间波动。此外,这5个KsdD在理化性质、细胞定位、蛋白跨膜区、信号肽、蛋白二级结构等方面表现出多样性,且和已知结构的红平红球菌SQ1中的KsdD1具有明显差异。利用异源表达技术将5个ksdD在*** BL21(DE3)进行表达,酶活与全菌转化结果表明,KsdD1、KsdD3、KsdD4与KsdD5在体外表现出了 KsdD的催化活性,而KsdD2无活性。利用破碎后的上清液作为粗酶液进行底物偏好性分析,结果表明,简单节杆菌的KsdD1、KsdD3、KsdD4和KsdD5之间底物偏好性存在一定差异。KsdD4对3-酮基甾体化合物表现出较高的催化活性,并且对一些特定的底物(如19-羟甲基二酮)也具有转化能力,其底物谱的范围明显优于阳性对照(红平红球菌SQ1的KsdD1、紫红红球菌DSM 43269的KsdD2和新金分枝杆菌TCCC 11208中的KsdD)。利用穿梭表达载体pART2AN构建系列简单节杆菌ksdD过表达菌株。全菌转化的结果表明,所有过表达菌株转化AD生成ADD的初始反应速率和产量均高于对照菌株。其中,KsdD3过表达菌株在转化0-6 h的初始转化速率为0.072 g/L·h,比对照菌株(0.052 g/L·h)提高了 38.5%,转化36 h后的ADD产量最大,为0.67 g/L,比对照菌株(0.48 g/L)提高了 39.5%,然后依次排序是 KsdD2>KsdD5>KsdD4>KsdD1。体外和体内功能验证发现KsdD3的效果最为明显,这暗示着KsdD3在菌株的C1,2脱氢反应中发挥着更为重要的作用。论文成果是对目前简单节杆菌关键催化酶KsdD研究认识的新补充,具有重要的科学意义。利用pK18mobsacB自杀载体,以ksdD4为目标基因进行简单节杆菌敲除技术的初步探索。结果发现,简单节杆菌的同源重组的效率非常低,利用该敲除系统无法在简单节杆菌中实现基因的敲除。该工作为今后建立简单节杆菌基因敲除系统提供了重要的基础数据。

关键词：简单节杆菌 3-甾酮-δ1-脱氢酶同工酶异源表达过表达

简单节杆菌来源的3-甾酮-δ1-脱氢酶的固定化及其催化性能研究

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简单节杆菌来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的固定化及其催化性能研究

作者：陈颖天津科技大学

学位级别：硕士

甾体化合物的生物脱氢在甾体药物的生产中有重要的作用。3-甾酮-δ1-脱氢酶(KsdD)具有较高的催化效率和选择性,能够催化AD(1,4-雄烯-3,17-二酮)生成ADD(1,4-雄烯-3,17-二酮),但游离酶稳定性低,限制了其工业应用,固定化酶可以解决这种问... 详细信息

甾体化合物的生物脱氢在甾体药物的生产中有重要的作用。3-甾酮-δ1-脱氢酶(KsdD)具有较高的催化效率和选择性,能够催化AD(1,4-雄烯-3,17-二酮)生成ADD(1,4-雄烯-3,17-二酮),但游离酶稳定性低,限制了其工业应用,固定化酶可以解决这种问题。本实验将野生型KsdD及其两个突变体通过共价结合的方式分别固定在环氧树脂载体上,通过对固定化条件及转化工艺的优化,实现其在生物脱氢中的连续应用。本实验的研究结果为:(1)确定最佳的固定化条件,确定共价固定化载体为环氧树脂ES1,缓冲液Na HPO-NaHPO的最适p H为6.5,缓冲液Na HPO-NaHPO的最适浓度为1.5 M,最佳的固定时间为12 h,酶与环氧树脂载体的最适添加例为2.5 mg酶/g树脂。(2)底物特异性研究表明AD为野生型固定化酶KsdD的最适底物;对固定化酶KsdD的温度和p H的活性和稳定性,有机溶剂的稳定性等酶学性质进行了分析,与游离酶不同,固定化酶KsdD的最适的催化反应温度为25℃,在小于45℃下反应时,活性依然能够保持在85%以上,温度稳定性研究表明,在25℃-35℃下保温2 h,KsdD酶活性能保留85%以上;最适催化的缓冲液为PBS(p H 7.5),p H稳定性研究表明,将固定化酶KsdD置于p H 7.5-8.5缓冲液中1 h,其残余相对酶活保持90%,固定化酶KsdD在有机溶剂(20%甲醇)中具有较高的耐受性。(3)固定化酶生物催化脱氢的最佳工艺条件为:AD的浓度为0.8 mg/m L,最适合溶解底物AD的溶剂为无水甲醇(6%),转化时间2 h,转化率可达90%以上。(4)以同样的固定化条件对突变体W299A和W299G进行了固定化处理,W299A表现出最高的催化性能,酶动力学研究表明,突变型W299A固定化酶的底物亲和力最高,其次是突变型W299G固定化酶,野生型固定化酶的底物亲和力最弱。(5)研究了野生型和突变型酶W299A和W299G的储存稳定性和重复使用性,固定化W299A在4℃孵育30天后仍保持了自身初始活性的66.3%,并且比游离的KsdD更稳定,15个重复反应结束后,固定化的突变体W299A、W299G和野生型KsdD分别保持了其初始活性的70.5%、65.7%和38.7%。固定化酶W299A的稳定性高,催化效率高,重复反应的效果好,是一种很有前途的甾体脱氢生物催化剂。

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶简单节杆菌固定化脱氢作用生物催化

简单节杆菌3-甾酮-δ1-脱氢酶重要同工酶的酶学性质及关键氨基酸位点的初步分析

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简单节杆菌3-甾酮-Δ1-脱氢酶重要同工酶的酶学性质及关键氨基酸...

作者：崔慧林天津科技大学

学位级别：硕士

甾体C1,2脱氢反应是甾体代谢中最具价值的反应之一,3-甾酮-δ1-脱氢酶(KsdD)是催化该反应的关键酶。简单节杆菌以专一性好,反应效率高等优点在甾体工业生产中得到广泛应用,但该菌株含有的KsdD信息尚不完全清楚。课题组前期通过对简单节... 详细信息

甾体C1,2脱氢反应是甾体代谢中最具价值的反应之一,3-甾酮-δ1-脱氢酶(KsdD)是催化该反应的关键酶。简单节杆菌以专一性好,反应效率高等优点在甾体工业生产中得到广泛应用,但该菌株含有的KsdD信息尚不完全清楚。课题组前期通过对简单节杆菌的全基因组测序,发现5个KsdD同工酶(依次命名为KsdD1、KsdD2、KsdD3、KsdD4与KsdD5),并通过单基因过表达和异源表达实验证实了它们的催化活性。在此基础上,本文对同工酶的转录方式、重要同工酶的酶学性质及关键氨基酸位点进行初步分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了野生型菌株和ksdD单基因过表达菌株的转录水平,结果发现,底物AD诱导12h后,野生型菌株中五个ksdD基因的转录水平均达到最大值(按照从高到低的顺序依次为ksdD4、ksdD3、KsdD5、KsdD1和KsdD2),之后,随着诱导时间的延长,五个ksdD基因的转录水平均随之降低。ksdD单基因过表达菌株中的ksdD的mRNA水平明显高于野生型菌株,同时,诱导时的底物浓度也影响了ksdD基因的转录水平。利用生物信息学方法预测了五个KsdD的启动子序列,并在ksdD2和ksdD3基因开放阅读框的上游发现了对甾体代谢具有重要调节作用的转录因子KstR的识别位点。使用已知结构的红平红球菌SQ1菌株的KsdD1为模板,对简单节杆菌的五个KsdD同工酶进行同源建模。结合课题组前期的KsdD底物谱数据,推测底物进出口袋位置的Loop结构可能是影响KsdD底物偏好性的重要原因。基于KsdD的体内作用大小,选取重要的KsdD3和KsdD5进行纯化和酶学性质研究。结果表明,KsdD3和KsdD5的最适温度分别为30℃和35℃,最适pH分别为:7.5和7.5,在20-30℃下两种酶都具有良好的热稳定性,并且二者在7.0-8.5和6.0-8.0范围内均表现出良好的pH稳定性,同时,二者表现出较强的有机溶剂耐受性且对4-烯-3-酮类的甾体化合物具有良好的偏好性。利用定点突变和底物转化的方法,对具有良好应用潜力的KsdD5的关键氨基酸残基进行了初步分析。结果表明,KsdD5底物结合位点的氨基酸残基(Y118、Y355、Y528和G532)发挥关键的作用,氨基酸残基M100和D117也发挥关键的作用,此外,KsdD5具有一些独特的关键氨基酸残基,如A255、R256、G258、V259、L261、F266和R273。而氨基酸残基T312和T490发挥着一定的作用。论文成果对于理解简单节杆菌KsdD的催化机理和后续的分子改造提供了重要的基础数据。

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶简单节杆菌酶学性质定点突变关键氨基酸

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

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化学与生物工程 2011年第7期28卷 29-34页

作者：陈苗苗林良才马昱澍王风清魏东芝华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(***)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD... 详细信息

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(***)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。

关键词：烟曲霉烟曲霉酸 3-甾酮-δ1-脱氢酶雄甾-4-烯-3,17-二酮雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

分枝杆菌Mycobacterium Neoaurum NwIB-01 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆表达

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化学与生物工程 2011年第7期28卷 39-43页

作者：张成刚王风清魏东芝华东理工大学生物工程学院鲁华生物技术研究所上海200237

通过分析已知两种分枝杆菌的3-甾酮-δ1-脱氢酶(kstD)碱基保守序列,设计简并引物,以甾醇降解菌株Mycobacterium neoaurumNwIB-01的DNA作模板,得到一个kstD基因片段,通过染色体走读,得到其完整的阅读框。以pUC18为异源表达载体,构建pTQ00... 详细信息

通过分析已知两种分枝杆菌的3-甾酮-δ1-脱氢酶(kstD)碱基保守序列,设计简并引物,以甾醇降解菌株Mycobacterium neoaurumNwIB-01的DNA作模板,得到一个kstD基因片段,通过染色体走读,得到其完整的阅读框。以pUC18为异源表达载体,构建pTQ002表达质粒,在***5α中对kstD进行了胞内活性表达,测定Mycobacteri-um neoaurumNwIB-01 kstD酶活为(0.37±0.05)***-1,约为原酶活的一半,为构建高效转化生成3-酮基-1,4-二烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶分枝杆菌染色体走读

简单节杆菌中关键3-甾酮-δ1-脱氢酶的活性区域和分子改造

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简单节杆菌中关键3-甾酮-Δ1-脱氢酶的活性区域和分子改造

作者：李芳天津科技大学

学位级别：硕士

简单节杆菌是现在工业上应用广泛的甾体C1,2脱氢反应菌株,因专一性强、反应效率高等优点。但研究者对该菌株中关键催化酶3-甾酮-δ1-脱氢酶（KsdD）的认识仍非常有限。课题组前期已经确定了简单节杆菌工业菌株CGMCC 14539中存在5个KsdD... 详细信息

简单节杆菌是现在工业上应用广泛的甾体C1,2脱氢反应菌株,因专一性强、反应效率高等优点。但研究者对该菌株中关键催化酶3-甾酮-δ1-脱氢酶（KsdD）的认识仍非常有限。课题组前期已经确定了简单节杆菌工业菌株CGMCC 14539中存在5个KsdD的同工酶。其中,KsdD5表现出较大的应用潜力。但课题组前期仅对KsdD同工酶的底物谱和KsdD5的关键氨基酸残基进行了初步分析。在此基础上,本论文对KsdD同工酶的底物谱、KsdD5的活性区域和氨基酸位点深入研究。底物谱分析结果表明,简单节杆菌的KsdD4和KsdD5、紫红红球菌DSM 43269的KsdD2和新金分枝杆菌TCCC 11028的KsdD可以转化C4,5位存在不饱和双键的底物,如六甲格氏物,但所有KsdD不能转化C1,2位有双健、C3位具有饱和A环且C5,6位存在双键的底物。通过构建loop区重组和C端截短突变体,以及酶活或底物转化实验,发现Loop区不是影响酶底物谱差异的原因,但却对酶的AD催化活性产生显著影响。C末端的6个二级结构在酶的催化活性中均发挥重要作用。之后,对课题组前期预测的KsdD5的13个氨基酸位点进行定点突变,5个位点（位于FAD结构域的A112、S131和G248,催化结构域的E332、S334）突变后的酶活下降20%以上,这说明这5个位点是重要的氨基酸残基。8个位点（位于FAD结构域的Y115、E133、P136和G152,位于催化结构域的L330、R347、M356和R384）的氨基酸发生突变后的酶活下降50%以上,说明这8个位点为关键的氨基酸残基。在确定的10个活性氨基酸位点上继续突变,并利用高通量酶活检测技术进行筛选,最终获得了优良组合突变体E332D/A112S,其对AD的酶活力和转化率比野生型分别提高了49.5%和19.8%。与野生型相比,E332D/A112S的最适温度提高了5℃,达到了40℃,最适p H提高了0.5,达到了8.0。分别利用低、中、高强度的启动子PM-10-△C、PM798、PM1210调控最优突变体在简单节杆菌中的表达水平,并考察不同生物量对转化性能的影响。结果发现,***/p ART2APM1210-E332D/A112S效果最好,在OD6.0的条件下,ADD的产量达到1.87g/L,比原始条件(OD2.0)提高了67%。该成果为酶的理性改造提供方法学指导和科学依据。

关键词： 3-甾酮-δ1-脱氢酶简单节杆菌 loop区重组 C端截短定点突变

用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造

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武汉大学学报（理学版） 2017年第1期63卷 51-56页

作者：余舒琪瞿旭东武汉大学药学院湖北武汉430072

工业上用于生产4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮,4-AD)的小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)在降解植物甾醇侧链的过程中同时产生部分1,4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(1,4-雄烯二酮,ADD),而3-甾酮-δ1-脱氢酶KstD催化了4-AD到ADD的转化.克隆该工业菌株的kstD基因测序后发现,其与报道的标准分枝杆菌基因组中的kstD基因相比有3个氨基酸的突变(A6E,S138L,A193V).这些突变使得KstD的酶活受到影响,一定程度上阻碍4-AD向ADD的转变.为了实现从植物甾醇降解中选择性地得到4-AD或ADD,通过敲除kstD基因,阻断4-AD到ADD的转化,获得一株只产4-AD的突变菌株,代谢产物中4-AD达79.3%.通过修复kstD酶的氨基酸位点,使之恢复到文献报道的正常序列,并在敲除kstD基因菌株中,将修复后的kstD基因安置在强启动子pG13下,重新导回到突变菌株中进行回补强化表达,获得一株可以大量产生ADD的菌株.野生型分枝杆菌转化植物甾醇产生的产物中,ADD仅占27.0%,经回补强化表达后的基因工程菌株转化植物甾醇产生的产物中ADD占63.0%.结果表明,通过敲除或者在突变体菌株中过表达正常的kstD基因可以使该工业菌株选择性地优产4-AD或ADD.

关键词：甾醇降解 1,4-雄烯二酮 4-雄烯二酮 3-甾酮-δ1-脱氢酶基因修复