简单节杆菌3-甾酮-Δ1-脱氢酶重要同工酶的酶学性质及关键氨基酸位点的初步分析

作     者：崔慧林 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：骆健美

授予年度：2020年

学科分类：081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：3-甾酮-Δ1-脱氢酶 简单节杆菌 酶学性质 定点突变 关键氨基酸 

摘      要：甾体C1,2脱氢反应是甾体代谢中最具价值的反应之一,3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD)是催化该反应的关键酶。简单节杆菌以专一性好,反应效率高等优点在甾体工业生产中得到广泛应用,但该菌株含有的KsdD信息尚不完全清楚。课题组前期通过对简单节杆菌的全基因组测序,发现5个KsdD同工酶(依次命名为KsdD1、KsdD2、KsdD3、KsdD4与KsdD5),并通过单基因过表达和异源表达实验证实了它们的催化活性。在此基础上,本文对同工酶的转录方式、重要同工酶的酶学性质及关键氨基酸位点进行初步分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了野生型菌株和ksdD单基因过表达菌株的转录水平,结果发现,底物AD诱导12h后,野生型菌株中五个ksdD基因的转录水平均达到最大值(按照从高到低的顺序依次为ksdD4、ksdD3、KsdD5、KsdD1和KsdD2),之后,随着诱导时间的延长,五个ksdD基因的转录水平均随之降低。ksdD单基因过表达菌株中的ksdD的mRNA水平明显高于野生型菌株,同时,诱导时的底物浓度也影响了ksdD基因的转录水平。利用生物信息学方法预测了五个KsdD的启动子序列,并在ksdD2和ksdD3基因开放阅读框的上游发现了对甾体代谢具有重要调节作用的转录因子KstR的识别位点。使用已知结构的红平红球菌SQ1菌株的KsdD1为模板,对简单节杆菌的五个KsdD同工酶进行同源建模。结合课题组前期的KsdD底物谱数据,推测底物进出口袋位置的Loop结构可能是影响KsdD底物偏好性的重要原因。基于KsdD的体内作用大小,选取重要的KsdD3和KsdD5进行纯化和酶学性质研究。结果表明,KsdD3和KsdD5的最适温度分别为30℃和35℃,最适pH分别为:7.5和7.5,在20-30℃下两种酶都具有良好的热稳定性,并且二者在7.0-8.5和6.0-8.0范围内均表现出良好的pH稳定性,同时,二者表现出较强的有机溶剂耐受性且对4-烯-3-酮类的甾体化合物具有良好的偏好性。利用定点突变和底物转化的方法,对具有良好应用潜力的KsdD5的关键氨基酸残基进行了初步分析。结果表明,KsdD5底物结合位点的氨基酸残基(Y118、Y355、Y528和G532)发挥关键的作用,氨基酸残基M100和D117也发挥关键的作用,此外,KsdD5具有一些独特的关键氨基酸残基,如A255、R256、G258、V259、L261、F266和R273。而氨基酸残基T312和T490发挥着一定的作用。论文成果对于理解简单节杆菌KsdD的催化机理和后续的分子改造提供了重要的基础数据。