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等离子体介导的氧化对虾类原肌球蛋白抗原表位及关键氨基酸结构和致敏性的影响

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等离子体介导的氧化对虾类原肌球蛋白抗原表位及关键氨基酸结构和...

作者：汪慧芬华南理工大学

学位级别：硕士

中国对虾(Penaeus chinensis)因其营养丰富广受消费者青睐。原肌球蛋白(TM)是引起虾类过敏反应最主要的蛋白质,引起过敏反应的并不是整个TM蛋白,而是TM蛋白上的一些片段即抗原表位,通过对抗原表位的加工可以改变其构象并影响致敏性。低... 详细信息

中国对虾(Penaeus chinensis)因其营养丰富广受消费者青睐。原肌球蛋白(TM)是引起虾类过敏反应最主要的蛋白质,引起过敏反应的并不是整个TM蛋白,而是TM蛋白上的一些片段即抗原表位,通过对抗原表位的加工可以改变其构象并影响致敏性。低温等离子体(CP)作为一种新型非热加工技术和高级氧化手段,可以有效改变蛋白质的构象,进而影响蛋白质的功能特性。目前关于CP介导的氧化处理对抗原表位及关键氨基酸的影响研究鲜有报道。因此,本课题以中国对虾中TM的抗原表位为研究对象,以CP介导的氧化微环境为切入点,结合等离子体物理学、分子生物学、生物信息学及免疫学等技术,从抗原表位预测、三维空间结构模拟、关键氨基酸分析、表位免疫学和结构变化、活性粒子屏蔽等几个方面,探究了CP氧化微环境对TM抗原表位结构的破坏及关键氨基酸的变化及过敏原性的影响,阐明了抗原表位结构(关键氨基酸)变化与致敏性之间的相互关系,为CP新型物理场消减虾类TM过敏原的内在机制提供了理论支撑,为甲壳类水产品过敏原的消除提供了新的思路和解决方案。主要研究结果如下:(1)TM抗原表位的空间模拟、筛选及关键氨基酸分析。采用Hopp-Woods、Kyte-Doolittle、Emini-surface Probability等算法预测并筛选得到中国对虾TM的12条抗原表位,通过SWISS-MODEL对中国对虾TM氨基酸序列分析、同源建模和可视化分析构建出TM和12条抗原表位的空间构象。另外,通过Fmoc方法合成得到12条抗原表位,鉴定其纯度、验证其分子量,并通过Ic-ELISA对合成的12条抗原表位进行筛选确定肽7(T7:LENRSLSDEERMDALENQ)和肽12(T12:DRLEDELVNEKEKYKSITDE)为致敏性最高的两条肽段;丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)以及酪氨酸(Tyr)被预测为潜在的关键致敏性氨基酸。(2)CP处理对TM关键抗原表位的结构和IgE/IgG结合能力影响分析。T7和T12的IgE/IgG结合能力随着CP处理时间(0-9 min)的延长逐渐上升,处理时间大于9 min后,T7和T12的IgE结合能力分别下降了9.97%和19.50%,其IgG结合能力分别下降了20.84%,21.99%。圆二色谱中的二级结构含量变化图表明,T7和T12经CP处理后α-螺旋、β-转角以及β-折叠含量几乎没有变化,但无规卷曲的含量均高于其他二级结构。紫外光谱结果表明,T7在0-9 min内紫外吸收升高,9-15 min内紫外吸收降低;而T12在0-6 min内紫外吸收升高,9 min紫外吸收降低,9-15 min后又升高。内源荧光光谱结果表明,两条多肽的内源荧光强度经CP处理0-9 min均呈现下降趋势,经CP处理9-12min荧光略有升高。紫外光谱和内源荧光光谱结果均表明CP处理改变了多肽的空间构象。(3)CP处理过程中主要活性粒子对TM抗原表位关键氨基酸致敏性的影响分析。自由基屏蔽剂处理结果表明,CP介导的氧化微环境中的主要活性粒子对T7的IgE结合能力的贡献值为·O(10.54%)>e(aq))(6.98%)>·OH(5.99%);而对T12的IgE结合能力的贡献值为·O(33.47%)>e(aq))(10.43%)>·OH(1.50%)。分子对接结果表明,T7与CP介导的氧化微环境中的活性粒子NO、NO连接的位点均为Glu131和Arg133;T12与NO连接的位点为Asp254、Leu256及Glu257,T12与NO连接的位点为Asp254、Arg255和Leu256,结合氨基酸频率分析结果,Glu131、Arg133、Arg255和Glu257均可作为突变的位点。氨基酸突变和Ic-ELISA结果表明,T7中Glu131和Arg133以及T12中Arg255为引起致敏性的最为关键的氨基酸。

关键词：抗原表位关键氨基酸等离子体原肌球蛋白致敏性

核桃中主要过敏原Jug r 1 B细胞线性表位中关键氨基酸的免疫信息学预测和识别

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食品科学 2021年第20期42卷 52-60页

作者：郝梦真毕源宋若琳陈锡车会莲食品质量与安全北京实验室中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

为确定影响Jug r 1线性表位致敏性的关键氨基酸,研究2种免疫信息学方法预测Jug r 1线性表位关键氨基酸的准确率和效率,以进一步认识核桃主要过敏原Jug r 1的B细胞线性表位。本研究通过2种免疫信息学的方法对Jugr1中3个线性表位上的关键... 详细信息

为确定影响Jug r 1线性表位致敏性的关键氨基酸,研究2种免疫信息学方法预测Jug r 1线性表位关键氨基酸的准确率和效率,以进一步认识核桃主要过敏原Jug r 1的B细胞线性表位。本研究通过2种免疫信息学的方法对Jugr1中3个线性表位上的关键氨基酸进行预测,采用丙氨酸扫描诱变法对关键氨基酸进行识别,采用固相合成技术合成Jug r 1系列突变多肽,以部分中国核桃过敏患者血清为探针,识别Jug r 1关键氨基酸。结果表明:表位1(4LVALLFVANAAA15)中的第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸和表位2(16FRTTITTMEIDEDID30)中的第20位异亮氨酸、第21位苏氨酸、第22位异亮氨酸以及表位3(125CGISSQRCEIRRSWF139)中的第127位异亮氨酸、第129位丝氨酸、第130位谷氨酰胺为关键氨基酸。使用两种免疫信息学结合预测的关键氨基酸准确率达到100%,但预测效率仅为11%。因此,使用2种免疫信息学结合的方式预测表位关键氨基酸可提高准确性,但会忽略一些关键氨基酸。免疫信息学结合丙氨酸扫描诱变法是识别表位关键氨基酸的重要研究思路。

关键词：核桃 Jug r 1 关键氨基酸线性表位免疫信息学

虾过敏原Pen a1抗原表位的关键氨基酸分析

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分析化学 2014年第11期42卷 1604-1610页

作者：牟慧高美须李淑荣王志东潘家荣赵杰支玉香李树锦赵鑫农业部农产品加工重点实验室/中国农业科学院农产品加工研究所北京农业职业学院中国计量学院生命科学院北京协和医院变态反应科

建立了一种利用表位抗体筛选虾过敏原Pen a1抗原表位中关键氨基酸的方法。利用生物信息学软件MEGA5计算Pen a1中表位的氨基酸组成和出现频率,并采用DNAMAN软件对SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析,综合两种方法筛选出... 详细信息

建立了一种利用表位抗体筛选虾过敏原Pen a1抗原表位中关键氨基酸的方法。利用生物信息学软件MEGA5计算Pen a1中表位的氨基酸组成和出现频率,并采用DNAMAN软件对SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析,综合两种方法筛选出各表位可能的关键氨基酸,Epitope 1:K,E,N;Epitope2:K,L,E;Epitope 3:E,R,D,L,Q;Epitope 5:K,L,Q。用丙氨酸取代并合成突变多肽。利用表位抗体,通过竞争性免疫斑点法及间接ELISA方法检测突变多肽的抗体结合能力,筛选出各表位的关键氨基酸。分别为:Epitope1:谷氨酰胺;Epitope2:亮氨酸和谷氨酸;Epitope3:亮氨酸和天冬氨酸;Epitope5:亮氨酸。实验结果证明了此种筛选关键氨基酸的方法的可行性,为Pen a1致敏机理的研究及利用基因修饰脱敏提供了一定的理论依据。

关键词： Pen a1 抗原表位突变多肽关键氨基酸

牛乳α-乳白蛋白免疫球蛋白G线性表位的关键氨基酸识别

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食品科学 2018年第7期39卷 195-200页

作者：丛艳君李晔刘家琦陈澍于晓凤李林峰食品添加剂与配料北京高校工程研究中心北京工商大学食品学院北京100048 北京友谊医院皮肤科北京100050

α-乳白蛋白是牛乳中的主要过敏原,开展α-乳白蛋白表位定位及氨基酸特性研究可深入了解过敏原的致敏机理,有助于更好地认识免疫球蛋白G(immunoglobulin G,Ig G)在乳过敏反应中的作用,为制备低过敏乳制品提供理论指导。本研究采用丙氨... 详细信息

α-乳白蛋白是牛乳中的主要过敏原,开展α-乳白蛋白表位定位及氨基酸特性研究可深入了解过敏原的致敏机理,有助于更好地认识免疫球蛋白G(immunoglobulin G,Ig G)在乳过敏反应中的作用,为制备低过敏乳制品提供理论指导。本研究采用丙氨酸免疫表位扫描技术识别α-乳白蛋白的关键氨基酸,即用牛乳过敏患者血清中Ig G识别α-乳白蛋白系列合成的多肽,筛选作用表位,然后用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽,以牛乳过敏患者血清池为抗体识别关键氨基酸。结果表明:α-乳白蛋白Ig G作用表位的氨基酸序列定位为aa6~20、aa21~35、aa36~50和aa86~100;关键氨基酸为第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸、第24位的脯氨酸、第26位的色氨酸和第32位的组氨酸。

关键词：牛乳过敏 α-乳白蛋白免疫球蛋白G作用表位关键氨基酸

牛乳α-乳白蛋白IgE线性表位的关键氨基酸识别

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食品科学 2017年第11期38卷 1-5页

作者：丛艳君陈澍李晔于晓凤李林峰北京工商大学食品学院食品添加剂与配料北京高校工程研究中心北京100048 北京友谊医院皮肤科北京100050

α-乳白蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。识别α-乳白蛋白作用表位及影响致敏性的关键氨基酸,对于揭示α-乳白蛋白致敏机理及低致敏乳制品的开发具有重要的意义。本研究采用固相合成技术合成α-乳白蛋白系列多肽,以牛乳过敏患者血... 详细信息

α-乳白蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。识别α-乳白蛋白作用表位及影响致敏性的关键氨基酸,对于揭示α-乳白蛋白致敏机理及低致敏乳制品的开发具有重要的意义。本研究采用固相合成技术合成α-乳白蛋白系列多肽,以牛乳过敏患者血清为探针,通过酶联免疫吸附分析法识别α-乳白蛋白的作用表位和关键氨基酸。结果表明:免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)E作用表位的氨基酸序列定位为aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115。α-乳白蛋白IgE作用表位关键氨基酸为第8位的缬氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位组氨酸。本研究可以为过敏原c DNA克隆以激活T细胞、降低IgE结合能力提供重要思路。

关键词：牛乳过敏 α-乳白蛋白作用表位关键氨基酸

海洋氧化节杆菌KQ11右旋糖苷酶催化位点关键氨基酸

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食品科学 2019年第6期40卷 113-120页

作者：刘乐丁一王紫玄房耀维王淑军吕明生淮海工学院海洋生命与水产学院江苏连云港222005 江苏省海洋资源开发研究院江苏连云港222005

通过同源比对,对来自海洋氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans KQ11)的右旋糖苷酶(记作AoDex)催化域及关键氨基酸进行预测,运用定点突变将AoDex催化域418-QTDGIELYKGSTMKNTFFNANDD-440中的5个氨基酸突变为甘氨酸,获得5种突变型右旋糖苷酶... 详细信息

通过同源比对,对来自海洋氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans KQ11)的右旋糖苷酶(记作AoDex)催化域及关键氨基酸进行预测,运用定点突变将AoDex催化域418-QTDGIELYKGSTMKNTFFNANDD-440中的5个氨基酸突变为甘氨酸,获得5种突变型右旋糖苷酶原核表达载体:pColdIII-KQN-Q418G、pColdIII-KQN-D420G、pColdIII-KQN-E423G、pColdIII-KQN-D439G、pColdIII-KQN-D440G,表达产物分别记为Q418GDex、D420GDex、E423GDex、D439GDex、D440GDex。经过发酵表达,Q418GDex、D420GDex、E423GDex、D439GDex几乎没有酶活力。D440GDex酶活力与AoDex一致;所不同的是,D440GDex在25～40℃时的酶活力提高了2～3倍,最适pH值也从AoDex的5.5变为6.5。数据表明,Q418、D420、E423、D439四个氨基酸残基是AoDex催化域中的关键氨基酸。D440突变为甘氨酸对该酶的性质有较大影响,也表明其不是催化域中的广义碱。本研究表明AoDex的催化机制与糖苷酶49家族是一致的,为AoDex的功能改造提供了理论支持。

关键词：右旋糖苷酶定点突变催化域关键氨基酸结构预测

关键氨基酸调控啤酒酵母适应高浓酿造环境胁迫的研究

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关键氨基酸调控啤酒酵母适应高浓酿造环境胁迫的研究

作者：任璐西北农林科技大学

学位级别：硕士

在啤酒高浓酿造过程中,影响酵母发酵性能的主要因素包括:发酵初期的高渗透压和发酵后期的高乙醇毒性。氮源缺乏是啤酒高浓酿造中普遍存在的问题,可导致酵母细胞活力降低、发酵性能下降。本研究的主要目标是:首先,分别研究不同麦汁浓度... 详细信息

在啤酒高浓酿造过程中,影响酵母发酵性能的主要因素包括:发酵初期的高渗透压和发酵后期的高乙醇毒性。氮源缺乏是啤酒高浓酿造中普遍存在的问题,可导致酵母细胞活力降低、发酵性能下降。本研究的主要目标是:首先,分别研究不同麦汁浓度和不同乙醇浓度条件下Lager酵母的生理特性和发酵性能;然后,通过相关性分析确定能够提高酵母活细胞率和发酵性能的关键氨基酸;最后,以麦汁发酵度和乙醇产量为主要衡量指标,按照原麦汁中关键氨基酸的比例,通过设置不同添加倍数来确定关键氨基酸的最适添加量,为啤酒高浓酿造工业化生产中优质氮源的选择提供理论依据和方法指导。论文主要研究结果如下:（1）研究不同浓度的全麦芽麦汁对酵母发酵性能、氨基酸同化和啤酒风味的影响。结果表明,麦汁浓度增大可显著提高乙醇产量、高级醇产量,减缓细胞生长,降低酵母活细胞率。与常浓（12°P）相比,16°P、20°P、24°P高浓酿造中乙醇产量分别提高了32%、43%、116%,发酵结束后酵母活细胞率分别为93.8%、88.50%、76.44%,高级醇产量分别提高了9%、13%、39%,风味酯分别降低了42%、55%、50%。通过高渗透压环境胁迫条件下酵母对游离氨基酸的同化量与发酵性能各指标之间的相关性分析说明:Ser、Met、Phe、Trp、His可改善酵母对高渗透压环境胁迫的适应性。（2）研究常浓（12°P）麦汁中添加不同浓度乙醇对酵母发酵性能、氨基酸同化和啤酒风味的影响。结果表明,随着乙醇浓度的升高,麦汁发酵度显著降低,与对照组相比,添加2%、4%、6%、8%、10%乙醇的麦汁发酵结束后,乙醇产量分别降低了17%、18%、34%、65%、99%,发酵结束时活细胞率分别为91.18%、89.85%、84.83%、72.36%、50%,最大悬浮细胞数分别降低了34%、48%、50%、70%、98%。添加10%的乙醇可导致发酵停滞,而且高浓酿造后期乙醇的大量累积是造成酵母细胞发酵性能衰减的最主要因素;在不同乙醇浓度下酵母对氨基酸的同化具有显著性变化,通过乙醇环境胁迫条件下酵母对游离氨基酸的同化量与发酵性能各指标之间的相关性分析说明:Asp、Ser、Gly、Arg、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu可改善酵母对高乙醇环境胁迫的适应性。（3）研究关键氨基酸不同添加倍数（0.5倍、1倍、2倍）对啤酒高浓酿造（24°P）中酵母发酵性能的影响。结果表明,十种关键氨基酸的补充可显著提高啤酒高浓酿造的发酵度、乙醇产量,显著促进酵母细胞数的生长并提高酵母活细胞率,改善啤酒色值。其中,补充1倍关键氨基酸混合物高浓麦汁发酵性能较好,与对照组相比,发酵度、乙醇产量、最大悬浮酵母细胞数和发酵结束酵母活细胞率分别提高了6%、17%、11%和10%;进一步验证了Ser、Met、Phe、Trp、Arg、His、Ile、Leu、Lys和Tyr是调控酵母细胞适应高渗透压和高乙醇毒性的关键氨基酸。添加氨基酸高浓酿造后的啤酒稀释后色泽依然鲜亮,且添加1倍关键氨基酸酿造而成的啤酒经稀释后△E最小,色泽最接近青岛纯生啤酒对照组。研究结果为啤酒高浓酿造工业生产中优质氮源的选择提供了可靠的理论依据。

关键词：啤酒高浓酿造高渗透压高乙醇毒性发酵性能关键氨基酸

定点突变法确定人体CYP2A6和CYP2A13香豆素代谢的关键氨基酸

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第2期30卷 126-131页

作者：何晓阳孙莉 SHEN Jian 洪钧言深圳大学生命科学院广东深圳518060 桂林医学院组织胚胎学教研室广西桂林541004 Aventis制药公司美国新泽西08807 新泽西医科牙科大学公共卫生学院/环境与职业健康研究所美国新泽西08854

【目的】通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基,提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记... 详细信息

【目的】通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基,提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记的依据。【方法】运用定点突变和Sf9昆虫杆状病毒蛋白表达体系产生CYP2A6和CYP2A13在300,301以及369位点氨基酸互换的突变体蛋白质,测定系列香豆素浓度下的各个酶蛋白对香豆素7-羥化的催化反应活性,获得动力学参数并与野生型酶蛋白进行比较分析。【结果】与野生型CYP2A6相比较,其Ile300→Phe突变体催化效率(Kcat=Vmax/Km)显著下降而Gly301→Ala突变体催化效率显著上升(1.64和8.02相对于野生型3.56,P氨基酸残基,无论是Ser还是Gly对CYP2A6或CYP2A13的香豆素7-羥化反应催化活性均无明显的影响。【结论】300和301位的氨基酸是影响CYP2A6及CYP2A13对香豆素7-羥化反应催化活性的关键残基,而369位氨基酸不影响此活性。

关键词： CYP2A6 CYP2A13 点突变香豆素代谢关键氨基酸

Pen a1抗原表位187—202关键氨基酸的筛选和鉴定

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中国农业科学 2014年第9期47卷 1793-1801页

作者：牟慧高美须潘家荣支玉香赵杰刘超超李树锦赵鑫农业部农产品加工重点实验室/中国农业科学院农产品加工研究所中国计量学院生命科学院北京协和医院变态反应科

【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法... 详细信息

【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5软件对Pen a1蛋白5个表位及其氨基酸的组成与出现频率进行分析,选出这些表位中出现频率大的氨基酸;对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析,筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA方法及竞争性Dot-blot方法检测突变的表位肽与表位抗体IgE结合能力,筛选出结合能力明显下降的突变肽,其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨基酸。【结果】谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)在表位中出现频率较大,并高于在Pen a1整体蛋白中出现的概率,为活性氨基酸。将序列在187—202的表位中氨基酸组成及出现频率进行统计,推测E、V、L可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白序列与Pen a1氨基酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对,K、L、E、V、G在所有比对的序列中都存在,表明这5个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L为可能的关键氨基酸,用丙氨酸替代表位中E、V、L分别合成1、2和3号突变肽。用竞争性Dot-blot检测突变肽结合抗体能力,以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原,用突变肽抑制虾蛋白结合抗体,发现原表位肽抑制作用明显,1号突变肽的抑制作用与原表位肽相似,2、3号肽的抑制作用明显低于原表位肽。谷氨酸突变的1号突变肽对表位活性并没有较大影响,说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸;而2、3号突变肽与抗体的结合能力明显降低,即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时,利用间接ELISA方法,将原表位肽和突变肽与兔血清反应,比较OD450值。结果显示,1号突变肽致敏性降低,OD450值约为对照的1/2.1,2号突变肽OD450值降低为对照的1/2.6,3号突变肽OD450值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不同程度的降低。结合竞争Dot-blot试验结果,亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后,其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降,是Pen a1中表位187—202的关键氨基酸。这种筛选关键氨基酸的方法可以用于其它抗原表位的关键氨基酸的确定及氨基酸对表位致敏性的影响,深入研究过敏原脱敏机理;同时也可用于基因工程或氨基酸修饰中降低过敏原致敏性。

关键词： Pen a1 抗原表位关键氨基酸竞争性Dot-blot 间接ELISA