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27nt-mirna对氧化低密度脂蛋白介导的血管内皮细胞管腔形成活性减弱的影响及其分子机制

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中国药学杂志 2021年第12期56卷 971-978页

作者：赵燕姣李丹颜渊鸳杨鹏罗雪兰欧和生广西医科大学药学院南宁530021 广西中医药大学附属国际壮医医院科技部南宁530201

目的探讨27nt-mirna对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成能力减弱的影响及相关分子机制。方法将HUVECs分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-mirna组、27nt-mirna反义序列(anti-27nt-mirna)组和mi... 详细信息

目的探讨27nt-mirna对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成能力减弱的影响及相关分子机制。方法将HUVECs分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-mirna组、27nt-mirna反义序列(anti-27nt-mirna)组和miR-NC组。正常对照组不做任何处理;Ox-LDL组用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h;27nt-mirna组、anti-27nt-mirna组和miR-NC组分别感染27nt-mirna高表达、27nt-mirna反义序列和随机阴性序列的慢病毒载体后,再用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h。采用qRT-PCR法检测27nt-mirna表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Matrigel实验检测细胞的成管能力;一步法检测细胞的一氧化氮产量;Western blot法和qRT-PCR法检测p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、eNOS的蛋白和(或)mRNA表达水平。结果与miR-NC组相比,27nt-mirna组细胞27nt-mirna高表达(P27nt-mirna组细胞NO的产量显著降低(Pnti-27nt-mirna组细胞的上述指标均较27nt-mirna组与miR-NC组升高(P27nt-mirna可能通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路的激活,抑制HUVECs的增殖和迁移,继而抑制血管形成,可能参与血管疾病的病理生理过程。

关键词： 27nt-mirna 人脐静脉内皮细胞氧化低密度脂蛋白管腔形成 PI3K/Akt/eNOS

27nt-mirna对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

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中国病理生理杂志 2020年第10期36卷 1745-1753页

作者：赵燕姣颜渊鸳李丹罗雪兰杨鹏周福隆杨瑞霞唐双意欧和生广西医科大学药学院广西南宁530021 广西中医药大学附属国际壮医医院科技部广西南宁530201 广西医科大学第一附属医院药学部广西南宁530021

目的:探讨27nt-mirna(27nt-miR)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HU⁃VECs)凋亡的影响及分子机制。方法:体外培养HUVECs,分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组和阴性对照+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡;27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组及阴性对照+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒质粒后用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡。采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞的迁移能力,caspase-3活性试剂盒检测细胞内caspase-3活性,RT-qPCR法和Western blot法检测细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与阴性对照+Ox-LDL组相比,27nt-miR+Ox-LDL组HUVECs的27ntmiR高表达可显著降低细胞活力和迁移能力(Pnti-27nt-miR+Ox-LDL组,上述所测指标均表现出相反趋势。结论:27nt-miR可能通过调控Bax、cas⁃pase-3和Bcl-2凋亡/抗凋亡蛋白的表达促进Ox-LDL体外诱导的HUVECs凋亡进而抑制HUVECs活力和迁移。

关键词： 27nt-mirna 人脐静脉内皮细胞氧化型低密度脂蛋白细胞凋亡

27nt-mirna对血管平滑肌细胞SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响

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中国病理生理杂志 2019年第2期35卷 200-205页

作者：沈凤杨鹏陶晓静李丹颜渊鸳罗雪兰秦祖杰覃裕旺欧和生广西医科大学药学院广西南宁530021 广西中医药大学附属广西国际壮医医院广西南宁530001

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-mirna)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-mirna高表达、反义序列(anti-27nt-mirna)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后... 详细信息

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-mirna)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-mirna高表达、反义序列(anti-27nt-mirna)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后分别转染大鼠原代VSMCs,加入血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs表型转换。MTT实验检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测细胞中SM22α的mRNA和蛋白表达情况。结果:与正常组相比,PDGF-BB组的细胞活力上升(P 27nt-mirna高表达组的细胞活力下降(P nti-27nt-mirna组细胞的细胞活力上升(P 27nt-mirna促进SM22α表达,同时抑制VSMCs的活力及迁移,并有可能抑制VSMCs从收缩型转变为合成型。

关键词： 27nt-mirna 血管平滑肌细胞表型平滑肌22α蛋白血小板源性生长因子

27nt-mirna通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控血管平滑肌细胞凋亡及其分子机制研究

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中国循环杂志 2020年第4期35卷 401-407页

作者：李丹杨鹏滕红丽颜渊鸳罗雪兰欧和生广西医科大学药学院广西壮族自治区南宁市530021 广西中医药大学附属广西国际壮医医院科技部

目的:探讨来源于一氧化氮合酶基因第四内含子的27碱基重复序列微小RNA(27nt-mirna)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡调控作用及潜在分子机制。方法:将大鼠主动脉VSMC分为空白对照组、雷帕霉素组、27... 详细信息

目的:探讨来源于一氧化氮合酶基因第四内含子的27碱基重复序列微小RNA(27nt-mirna)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡调控作用及潜在分子机制。方法:将大鼠主动脉VSMC分为空白对照组、雷帕霉素组、27nt-mirna组、27nt-mirna反义序列(anti-27ntmirna)组、阴性对照组。27nt-mirna组:转染27nt-mirna正义链慢病毒载体;anti-27nt-mirna组:转染27ntmirna反义链慢病毒载体;阴性对照组:转染随机阴性序列慢病毒载体。除空白对照组外,雷帕霉素组与各转染组细胞给予100 ng/ml雷帕霉素诱导培养2 h诱导凋亡。荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证27nt-mirna慢病毒稳转细胞株构建情况;CCK-8法、流式细胞术、qRT-PCR法与蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测各组细胞增殖能力、细胞凋亡率与周期分布以及mTOR、磷酸化-mTOR(p-mTOR)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的信使RNA(mRNA)和(或)蛋白表达水平。结果:慢病毒转染VSMC后,27nt-mirna稳转细胞株构建成功,雷帕霉素可抑制VSMC的mTOR mRNA与p-mTOR蛋白表达水平。与阴性对照组相比,27nt-mirna组细胞的活力与增殖能力显著增强,且细胞凋亡率显著降低(P均27nt-mirna通过负调控m TOR基因转录水平与蛋白磷酸化水平抑制VSMC凋亡,其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax和caspase-3蛋白表达有关。

关键词： 27nt-mirna 血管平滑肌细胞凋亡哺乳动物雷帕霉素靶蛋白磷酸化

27nt-mirna对血管内皮细胞管腔形成和鸡胚尿囊膜血管新生的影响及相关机制研究

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27nt-miRNA对血管内皮细胞管腔形成和鸡胚尿囊膜血管新生的影响及...

作者：陶晓静广西医科大学

学位级别：硕士

目的本课题组前期研究提示,来源于内皮特异型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4内含子的27碱基重复序列的27nt-mirna可负反馈调控其宿主基因eNOS的转录和蛋白表达。本研究拟通过慢病毒转染建立27nt-mirna高表达... 详细信息

目的本课题组前期研究提示,来源于内皮特异型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4内含子的27碱基重复序列的27nt-mirna可负反馈调控其宿主基因eNOS的转录和蛋白表达。本研究拟通过慢病毒转染建立27nt-mirna高表达的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),体外实验探究27nt-mirna对HUVECs增殖、迁移和管腔形成的影响及分子机制;体内实验进一步探究27nt-mirna对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管新生的影响,深入探讨27nt-mirna在心血管系统发育和心血管疾病发生发展中的作用。方法1 HUVECs的培养及慢病毒转染委托上海吉凯基因化学技术有限公司根据相应的mirna序列设计、构建27nt-mirna、anti-27nt-mirna及空白对照载体,经PCR鉴定及DNA测序比对分析确定载体构建成功后用慢病毒包装载体形成27nt-mirna、anti-27nt-mirna及对照慢病毒液。将慢病毒分别转染HUVECs后分为:27nt-mirna高表达组、anti-27nt-mirna组和对照组。荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达强度并采用流式细胞术检测细胞慢病毒转染效率确定27nt-mirna细胞株建立情况。2 27nt-mirna对HUVECs增殖、迁移和管腔形成的影响构建27nt-mirna、anti-27nt-mirna及对照载体并包装入慢病毒,分别转染HUVECs后分为27nt-mirna组、anti-27nt-mirna组和对照组,采用四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)比色法检测各组细胞的增殖能力;采用划痕试验(Scratch test)检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底胶(Matrigel)检测各组细胞的体外管腔形成能力。3 27nt-mirna对转染后各组细胞eNOS及转录因子Sp1表达的影响构建27nt-mirna过表达、anti-27nt-mirna及对照载体并包装入慢病毒,分别转染HUVECs后分为:27nt-mirna高表达组、anti-27nt-mirna组和对照组,采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测eNOS及Sp1的mRNA表达水平;采用免疫细胞化学法(Immunocytochemistry)及免疫印迹试验(Western blotting)检测eNOS及Sp1的蛋白表达情况;采用一步法检测细胞及培养液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的浓度。4探究27nt-mirna对CAM血管新生的影响构建27nt-mirna高表达、anti-27nt-mirna及对照载体并包装入慢病毒,采用CAM模型转染相应慢病毒后分为:27nt-mirna高表达组、anti-27nt-mirna组和对照组,观测各组CAM血管面积占总CAM面积的百分比。结果1荧光显微镜下可见转染后的细胞绿色荧光较强,细胞状态良好,流式细胞术结果表明27nt-mirna高表达组、anti-27nt-mirna组和空白对照组的慢病毒转染效率均达到90%以上,细胞株构建成功。2与对照组比较,27nt-mirna组HUVECs增殖活性明显下降(P27nt-mirna组HUVECs内eNOS和Sp1的mRNA(P27nt-mirna组的CAM血管新生面积降低(P27nt-mirna显著抑制体外HUVECs增殖、迁移和成管能力。2 27nt-mirna显著抑制HUVECs的eNOS和Sp1的mRNA和蛋白表达,27nt-mirna可能协同Sp1调控eNOS的表达进而影响HUVECs的细胞功能,包括增殖、迁移和成管能力。3 27nt-mirna显著抑制CAM血管新生。

关键词： 27nt-mirna 内皮型一氧化氮合酶转录因子Sp1 血管内皮细胞管腔形成血管新生

27nt-mirna对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤的影响与机制研究

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27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤的影响与机制...

作者：赵燕姣广西医科大学

学位级别：硕士

目的:建立氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤模型,观察Ox-LDL对血管内皮细胞功能的影响,探讨来源于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)第四内含子中的27碱基重复序列转录的27nt-mirna对Ox-LDL诱导HUVECs损伤的影响及其分子调控机制,为27nt-mirna应用于动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)疾病的治疗提供理论及实践依据。方法:***的体外培养及27nt-mirna慢病毒载体转染以27nt-mirna序列:5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’为依据,设计、合成、构建27nt-mirna高表达、anti-27nt-mirna及阴性对照慢病毒载体,分别转染HUVECs后,采用荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,流式细胞术检测慢病毒转染效率,q RT-PCR法检测27nt-mirna的表达量。2.27nt-mirna对Ox-LDL诱导损伤的HUVECs凋亡、增殖、迁移及血管形成的影响用含10μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L的Ox-LDL处理HUVECs 48 h,采用流式细胞术和MTT法检测细胞的凋亡率和增殖能力,确定Ox-LDL诱导HUVECs损伤的浓度。将HUVECs分为:正常对照组、Ox-LDL组、27nt-mirna+Ox-LDL组、anti-27nt-mirna+Ox-LDL组和mirna-NC+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤;27nt-mirna+Ox-LDL组、anti-27nt-mirna+Ox-LDL组和mirna-NC+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒后用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤。采用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验和Transwell检测细胞迁移能力;Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测细胞凋亡率;人工基底胶检测细胞管腔形成能力;q RT-PCR和Western blot检测27nt-mirna、e NOS、VEGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2 m RNA和/或蛋白表达水平;硝酸还原法检测NO的产量。3.27nt-mirna通过PI3K/Akt通路调节氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞损伤将HUVECs分为:Ox-LDL组、anti-27nt-mirna+Ox-LDL组、LY294002+Ox-LDL组和LY294002+anti-27nt-mirna+Ox-LDL组。Ox-LDL组和anti-27nt-mirna+Ox-LDL组用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤;LY294002+Ox-LDL组和LY294002+anti-27nt-mirna+Ox-LDL组先用含0.45μg/m L PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理0.5 h,再用40μg/m L Ox-LDL处理48 h诱导细胞损伤。采用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验和Transwell检测细胞迁移能力;Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测细胞凋亡率;人工基底胶检测细胞管腔形成能力;q RT-PCR法检测27nt-mirna表达情况;Western blot检测p-Akt、e NOS、VEGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平;硝酸还原法检测NO的产量。结果:1.荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光,流式细胞术结果表明三种慢病毒转染效率均达90%以上。此外,q RT-PCR结果表明,与正常对照组比较,27nt-mirna组HUVECs内27nt-mirna的表达量增加(Pnti-27nt-mirna组HUVECs内27nt-mirna的表达量降低(P27nt-mirna的表达上调(P27nt-mirna高表达可使细胞活力与迁移能力显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),管腔形成能力显著降低(P<0.05),e N

关键词： 27nt-mirna 人脐静脉内皮细胞氧化低密度脂蛋白 PI3K/Akt信号通路

27nt-mirna对eNOS表达/活性调节及NO生成、血管新生的影响及相关机制研究

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27nt-miRNA对eNOS表达/活性调节及NO生成、血管新生的影响及相关...

作者：罗雪兰广西医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题组前期研究显示,27nt-mirna由内皮型NOS(eNOS)的第4内含子27碱基重复序列产生,并负性调控eNOS的转录水平和蛋白表达水平。本研究进一步探讨27nt-mirna对eNOS表达、活性的调节及代谢产物NO的生成、血管新生的影响及相关分子... 详细信息

目的:本课题组前期研究显示,27nt-mirna由内皮型NOS(eNOS)的第4内含子27碱基重复序列产生,并负性调控eNOS的转录水平和蛋白表达水平。本研究进一步探讨27nt-mirna对eNOS表达、活性的调节及代谢产物NO的生成、血管新生的影响及相关分子机制研究:1)研究27nt-mirna对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节及其相关分子调控机制;2)明确27nt-mirna对血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响及其分子机制;3)阐明27nt-mirna对细胞增殖、迁移和管腔形成的影响及其相关分子机制,为分子水平治疗心血管疾病提供理论依据。方法:1)构建27nt-mirna野生型与突变型基因序列的高表达质粒,使用X-treme GENE HP DNA脂质体进行转染,根据所染的质粒将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分为:空白质粒对照组(Control group)、野生型27-nt-mirna质粒组(Wt-27-ntmirna组)和突变型27-nt-mirna质粒组(Mut-27-nt-mirna组)。2)检测27nt-mirna对eNOS基因表达的影响:将空白质粒、Wt-27-ntmirna质粒和Mut-27-nt-mirna质粒转染入HUVECs。应用RT-PCR实验检测eNOS mRNA和核转录因子AP-1 mRNA转录水平的改变;应用免疫细胞化学实验(Immunocytochemistry)和免疫印迹实验(western blotting)检测eNOS蛋白和核转录因子AP-1蛋白表达水平的改变。3)检测27nt-mirna对eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-mirna质粒和Mut-27-nt-mirna质粒转染入HUVECs。应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定不同时间细胞培养液中eNOS活性的变化;应用硝酸还原法测定不同时间细胞培养上清液中NO生成的变化。4)检测27nt-mirna对HUVECs增殖的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-mirna质粒和Mut-27-nt-mirna质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,并于24、48和72 h三个时间点,采用MTT法检测各实验HUVECs的增殖能力。5)检测27nt-mirna对HUVECs迁移和管腔形成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-mirna质粒和Mut-27-nt-mirna质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,采用划痕试验检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底膜(Matrigel)检测各组细胞的管腔形成能力。结果:1)与对照组比较,27nt-mirna高表达组eNOS mRNA和AP-1 mRNA转录水平明显降低(P27nt-mirna高表达组细胞培养液上清中eNOS活性明显减弱(P27nt-mirna高表达组的细胞增殖能力明显降低(P27nt-mirna显著抑制血管内皮细胞eNOS mRNA转录和蛋白表达,显著抑制核转录因子AP-1 mRNA转录和蛋白表达,AP-1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。2)27nt-mirna显著抑制血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO的生成,并且可能与其对eNOS基因的调控表达有关。3)27nt-mirna显著抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,可能与其对eNOS基因的调控表达有关,并且eNOS/NO/可能是其调控的相关通路之一。

关键词： 27nt-mirna 内皮型一氧化氮合酶 AP-1 血管内皮细胞一氧化氮管腔形成

基于mTOR信号因子初探27nt-mirna调控血管平滑肌细胞自噬—凋亡交互应答

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基于mTOR信号因子初探27nt-miRNA调控血管平滑肌细胞自噬—凋亡交...

作者：李丹广西医科大学

学位级别：硕士

1研究目的本课题组前期研究发现来源于一氧化氮合酶基因(eNOS)第四内含子27个碱基重复序列(定义为“27nt-mirna”)以增强子的方式抑制eNOS基因表达和血管NO产物,并参与VSMC表型转换的调控,故而推测27nt-mirna可能参与调控VSMC其他关键... 详细信息

1研究目的本课题组前期研究发现来源于一氧化氮合酶基因(eNOS)第四内含子27个碱基重复序列(定义为“27nt-mirna”)以增强子的方式抑制eNOS基因表达和血管NO产物,并参与VSMC表型转换的调控,故而推测27nt-mirna可能参与调控VSMC其他关键功能。本研究以自噬和凋亡功能为切入点初步探索内皮源性27nt-mirna对人主动脉血管平滑肌细胞的调控作用,预测并验证27nt-mirna参与调控人主动脉VSMC自噬-凋亡交互应答的潜在靶基因,以期为动脉粥样硬化疾病药物治疗分子化提供理论基础及其潜在治疗靶点。2实验方法2.1 27nt-mirna慢病毒载体转染VSMC根据实验要求,将人主动脉VSMC随机分四组:正常对照组、pre-27nt-mirna组、anti-27nt-mirna组、阴性对照(miR-NC)组。正常对照组的VSMC不给于任何处理,其余三组分别转染pre-27nt-mirna、anti-27nt-mirna、miR-NC慢病毒载体。转染完成后采用流式细胞术检测GFP绿色荧光表达情况,RT-qPCR法检测转染前后27nt-mirna表达水平差异,两者结合验证转染是否成功。2.2检测各组VSMC自噬水平与分子调控水平根据实验要求,采用厄尔平衡盐溶液(EBSS)诱导细胞自噬,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS 组、pre-27nt-mirna 组、anti-27nt-mirna组和miR-NC组,除正常对照组外,其余组别均给予EBSS(1×)培养6h诱导自噬。透射电镜观察各组细胞自噬小体超微结构;Lyso-tracker Red染色法观察各组细胞自噬溶酶体;RT-qPCR法检测LC3B、Beclin-1和p62的mRNA表达水平;免疫印迹实验(Westernblot)法检测LC3B、Beclin-1和p62蛋白表达量。2.3检测各组VSMC凋亡水平及分子调控水平根据实验要求,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS组(凋亡诱导模型)、pre-27nt-mirna 组、anti-27nt-mirna 组和 miR-NC 组,除正常对照组外,其余组均给予EBSS(1×)培养24h诱导凋亡。CCK-8法检测各组细胞活力与增殖能力;流式细胞术检测各组细胞分裂周期比例(PI单染法)及细胞凋亡率(Annexin V-APC/7-AAD双染法);RT-qPCR法检测Bcl-2、Bax 和 caspase-3 的 mRNA 水平;Westernblot 法检测 Bcl-2、Bax 和 caspase-3蛋白表达量。2.4预测并验证27nt-mirna潜在靶基因首先在miRBase、miRDB和TargetScan7.2生物学信息数据库预测27nt-mirna靶基因,根据GO、KEGG和HRPD数据库进行筛选。如若数据库中不能检索,则根据文献调研及前期实验基础选定潜在靶基因进行验证。在靶基因抑制剂作用下,采用RT-qPCR法和Western blot法初步验证潜在靶基因功能表达水平。根据荧光素酶活性报告基因系统实验要求,构建含有靶基因3’UTR野生型(wt)和突变型(mut)的基因报告质粒及pmirGLO对照质粒载体,以及27nt-mirna过表达和阴性对照质粒,先转染mirna质粒(分别含过表达和阴性对照序列),再分别转染靶基因报告质粒和pmirGLO载体质粒。转染48h后裂解细胞,分别检测萤火虫萤光素酶(LCU1)和海肾荧光素酶(LCU2)活性,计算LCU1/LCU2比值并分析。3 实验结果3.1 27nt-mirna慢病毒载体转染VSMC可调节其表达水平以感染指数MOI=80转染VSMC,转染后细胞基本表达GFP绿色荧光,经嘌呤霉素筛选后细胞表达绿色荧光比例可达90%。RT-qPCR结果显示转染后,pre-27nt-mirna组mirna表达水平较转染前升高近三倍(Pnti-27nt-mirna的mirna表达水平较转染前显著降低(P27nt-mirna表达水平。3.2 27nt-mirna过表达促进EBSS诱导的VSMC自噬在细胞自噬检测结果中,正常对照组细胞偶见自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较弱;而EBSS组可见较多自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较正常对照组强烈(P27nt-mirna组的自噬小体与自噬溶酶体生成情况均多于miR-NC组(Pnti-27nt-mirna均弱于miR-NC组(P<0.05),与miR-NC无组间差异。在基因转录水平与蛋白表达水平检测中,与正常对照组比较,EBSS组LC3B和Beclin-1

关键词： 27nt-mirna 血管平滑肌细胞自噬凋亡 mTOR信号因子

内皮源性27nt-mirna对血管平滑肌细胞表型转换、增殖与凋亡的影响及相关机制研究

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内皮源性27nt-miRNA对血管平滑肌细胞表型转换、增殖与凋亡的影响...

作者：沈凤广西医科大学

学位级别：硕士

目的1研究内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转换及其相关分子机制。2探讨内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡等细胞功能的影响。方法1慢病毒构建、转染及VS... 详细信息

目的1研究内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转换及其相关分子机制。2探讨内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡等细胞功能的影响。方法1慢病毒构建、转染及VSMCs去分化模型的建立慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司根据相应的mi RNA序列设计、构建,经PCR鉴定及DNA测序比对分析确定载体构建成功后用慢病毒包装载体形成27nt-mi RNA高表达、anti-27nt-mi RNA及阴性对照NC慢病毒液。将慢病毒分别转染VSMCs后,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况以确定27nt-mi RNA细胞株建立情况。2检测27nt-mi RNA对VSMCs表型转换的影响根据实验设计要求,将VSMCs随机分五组:分别为正常对照组(normal)、PDGF-BB组、mimic 27nt-mi RNA+PDGF-BB组、Anti-27nt-mi RNA+PDGF-BB组、NC+PDGF-BB组。正常对照组的VSMCs不给予任何处理、PDGF-BB组的VSMCs用10 ng/m L PDGF-BB共培养48h建立去分化模型、其余三组的VSMCs分别转染27nt-mi RNA高表达慢病毒、Anti-27nt-mi RNA慢病毒、阴性对照NC慢病毒,然后用10 ng/m L PDGF-BB共培养48h建立去分化模型。RT-PCR实验检测VSMCs收缩型相关基因SMA、SM22αm RNA水平;免疫印迹法(Western blotting)和免疫细胞化学法(Immunocytochemistry)检测SMA和SM22α蛋白水平。3检测27nt-mi RNA对VSMCs增殖、迁移及凋亡的影响根据实验设计要求,将VSMCs随机分为阴性对照组NC、mimic27nt-mi RNA组、Anti-27nt-mi RNA组。三组VSMCs分别转染阴性对照慢病毒NC、27nt-mi RNA高表达慢病毒、Anti-27nt-mi RNA慢病毒。细胞计数法、MTT法检测各组VSMCs的增殖能力;划痕试验检测各组VSMCs迁移能力;Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况及流式细胞术检测各组VSMCs凋亡率。结果1慢病毒转然后,在荧光显微镜下可观察到强烈的绿色荧光,感染率达90%,细胞状态良好,细胞株构建成功。2在表型转换实验中,与正常组比较,PDGF-BB组的SMA、SM22αm RNA和蛋白表达量均显著降低(P27nt-mi RNA+PDGF-BB组的SMA、SM22αm RNA和蛋白表达量较NC+PDGF-BB组、Anti-27nt-mi RNA+PDGF-BB组显著升高(P27nt-mi RNA组VSMCs的增殖能力、迁移能力受到抑制(Pnti-27nt-mi RNA组VSMCs的增殖能力、迁移能力增加(P0.05)。结论1内皮源性27nt-mi RNA可在转录水平促进VSMCs“收缩型”相关基因SMA、SM22α的表达,可以抑制PDGF-BB诱导的细胞表型转换。2内皮源性27nt-mi RNA能显著抑制VSMCs增殖、迁移能力,以及诱导VSMCs凋亡。

关键词： 27nt-mirna 血管平滑肌细胞表型转换 SMA SM22α