基于mTOR信号因子初探27nt-miRNA调控血管平滑肌细胞自噬—凋亡交互应答

作     者：李丹 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧和生

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：27nt-miRNA 血管平滑肌细胞 自噬 凋亡 mTOR信号因子 

摘      要：1研究目的本课题组前期研究发现来源于一氧化氮合酶基因(eNOS)第四内含子27个碱基重复序列(定义为“27nt-miRNA)以增强子的方式抑制eNOS基因表达和血管NO产物,并参与VSMC表型转换的调控,故而推测27nt-miRNA可能参与调控VSMC其他关键功能。本研究以自噬和凋亡功能为切入点初步探索内皮源性27nt-miRNA对人主动脉血管平滑肌细胞的调控作用,预测并验证27nt-miRNA参与调控人主动脉VSMC自噬-凋亡交互应答的潜在靶基因,以期为动脉粥样硬化疾病药物治疗分子化提供理论基础及其潜在治疗靶点。2实验方法2.1 27nt-miRNA慢病毒载体转染VSMC根据实验要求,将人主动脉VSMC随机分四组:正常对照组、pre-27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组、阴性对照(miR-NC)组。正常对照组的VSMC不给于任何处理,其余三组分别转染pre-27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA、miR-NC慢病毒载体。转染完成后采用流式细胞术检测GFP绿色荧光表达情况,RT-qPCR法检测转染前后27nt-miRNA表达水平差异,两者结合验证转染是否成功。2.2检测各组VSMC自噬水平与分子调控水平根据实验要求,采用厄尔平衡盐溶液(EBSS)诱导细胞自噬,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS 组、pre-27nt-miRNA 组、anti-27nt-miRNA组和miR-NC组,除正常对照组外,其余组别均给予EBSS(1×)培养6h诱导自噬。透射电镜观察各组细胞自噬小体超微结构;Lyso-tracker Red染色法观察各组细胞自噬溶酶体;RT-qPCR法检测LC3B、Beclin-1和p62的mRNA表达水平;免疫印迹实验(Westernblot)法检测LC3B、Beclin-1和p62蛋白表达量。2.3检测各组VSMC凋亡水平及分子调控水平根据实验要求,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS组(凋亡诱导模型)、pre-27nt-miRNA 组、anti-27nt-miRNA 组和 miR-NC 组,除正常对照组外,其余组均给予EBSS(1×)培养24h诱导凋亡。CCK-8法检测各组细胞活力与增殖能力;流式细胞术检测各组细胞分裂周期比例(PI单染法)及细胞凋亡率(Annexin V-APC/7-AAD双染法);RT-qPCR法检测Bcl-2、Bax 和 caspase-3 的 mRNA 水平;Westernblot 法检测 Bcl-2、Bax 和 caspase-3蛋白表达量。2.4预测并验证27nt-miRNA潜在靶基因首先在miRBase、miRDB和TargetScan7.2生物学信息数据库预测27nt-miRNA靶基因,根据GO、KEGG和HRPD数据库进行筛选。如若数据库中不能检索,则根据文献调研及前期实验基础选定潜在靶基因进行验证。在靶基因抑制剂作用下,采用RT-qPCR法和Western blot法初步验证潜在靶基因功能表达水平。根据荧光素酶活性报告基因系统实验要求,构建含有靶基因3’UTR野生型(wt)和突变型(mut)的基因报告质粒及pmirGLO对照质粒载体,以及27nt-miRNA过表达和阴性对照质粒,先转染miRNA质粒(分别含过表达和阴性对照序列),再分别转染靶基因报告质粒和pmirGLO载体质粒。转染48h后裂解细胞,分别检测萤火虫萤光素酶(LCU1)和海肾荧光素酶(LCU2)活性,计算LCU1/LCU2比值并分析。3 实验结果3.1 27nt-miRNA慢病毒载体转染VSMC可调节其表达水平以感染指数MOI=80转染VSMC,转染后细胞基本表达GFP绿色荧光,经嘌呤霉素筛选后细胞表达绿色荧光比例可达90%。RT-qPCR结果显示转染后,pre-27nt-miRNA组miRNA表达水平较转染前升高近三倍(P0.05),而anti-27nt-miRNA的miRNA表达水平较转染前显著降低(P0.05),miR-NC组与正常对照组无显著性差异,说明转染慢病毒载体可在不同程度调节27nt-miRNA表达水平。3.2 27nt-miRNA过表达促进EBSS诱导的VSMC自噬在细胞自噬检测结果中,正常对照组细胞偶见自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较弱;而EBSS组可见较多自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较正常对照组强烈(P0.05),miR-NC组表现与之无显著差异;而pre-27nt-miRNA组的自噬小体与自噬溶酶体生成情况均多于miR-NC组(P0.05);上述两个指标中anti-27nt-miRNA均弱于miR-NC组(P0.05),与miR-NC无组间差异。在基因转录水平与蛋白表达水平检测中,与正常对照组比较,EBSS组LC3B和Beclin-1