内皮源性27nt-miRNA对血管平滑肌细胞表型转换、增殖与凋亡的影响及相关机制研究

作     者：沈凤 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧和生

授予年度：2019年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：27nt-miRNA 血管平滑肌细胞 表型转换 SMA SM22α 

摘      要：目的1研究内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转换及其相关分子机制。2探讨内皮源性27nt-mi RNA对主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡等细胞功能的影响。方法1慢病毒构建、转染及VSMCs去分化模型的建立慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司根据相应的mi RNA序列设计、构建,经PCR鉴定及DNA测序比对分析确定载体构建成功后用慢病毒包装载体形成27nt-mi RNA高表达、anti-27nt-mi RNA及阴性对照NC慢病毒液。将慢病毒分别转染VSMCs后,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况以确定27nt-mi RNA细胞株建立情况。2检测27nt-mi RNA对VSMCs表型转换的影响根据实验设计要求,将VSMCs随机分五组:分别为正常对照组(normal)、PDGF-BB组、mimic 27nt-mi RNA+PDGF-BB组、Anti-27nt-mi RNA+PDGF-BB组、NC+PDGF-BB组。正常对照组的VSMCs不给予任何处理、PDGF-BB组的VSMCs用10 ng/m L PDGF-BB共培养48h建立去分化模型、其余三组的VSMCs分别转染27nt-mi RNA高表达慢病毒、Anti-27nt-mi RNA慢病毒、阴性对照NC慢病毒,然后用10 ng/m L PDGF-BB共培养48h建立去分化模型。RT-PCR实验检测VSMCs收缩型相关基因SMA、SM22αm RNA水平;免疫印迹法(Western blotting)和免疫细胞化学法(Immunocytochemistry)检测SMA和SM22α蛋白水平。3检测27nt-mi RNA对VSMCs增殖、迁移及凋亡的影响根据实验设计要求,将VSMCs随机分为阴性对照组NC、mimic27nt-mi RNA组、Anti-27nt-mi RNA组。三组VSMCs分别转染阴性对照慢病毒NC、27nt-mi RNA高表达慢病毒、Anti-27nt-mi RNA慢病毒。细胞计数法、MTT法检测各组VSMCs的增殖能力;划痕试验检测各组VSMCs迁移能力;Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况及流式细胞术检测各组VSMCs凋亡率。结果1慢病毒转然后,在荧光显微镜下可观察到强烈的绿色荧光,感染率达90%,细胞状态良好,细胞株构建成功。2在表型转换实验中,与正常组比较,PDGF-BB组的SMA、SM22αm RNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05)。结论1内皮源性27nt-mi RNA可在转录水平促进VSMCs“收缩型相关基因SMA、SM22α的表达,可以抑制PDGF-BB诱导的细胞表型转换。2内皮源性27nt-mi RNA能显著抑制VSMCs增殖、迁移能力,以及诱导VSMCs凋亡。