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黑龙江林蛙瘦素受体基因克隆及其在感染中的表达分析

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第2期39卷 244-258页

作者：许冬梅郭晶晶任慧敏赵雪滢刘玉芬刘鹏赵文阁哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025

黑龙江林蛙(Rana amurensis)在东北地区森林生态系统保护中发挥重要作用,同时又具有很高经济价值。瘦素受体(leptin receptor,LEPR)属于I类细胞因子受体超家族成员,是调节能量代谢、调控免疫应答的关键因子。为研究LEPR基因在嗜水气单胞... 详细信息

黑龙江林蛙(Rana amurensis)在东北地区森林生态系统保护中发挥重要作用,同时又具有很高经济价值。瘦素受体(leptin receptor,LEPR)属于I类细胞因子受体超家族成员,是调节能量代谢、调控免疫应答的关键因子。为研究LEPR基因在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染中的作用,利用RT-PCR方法克隆黑龙江林蛙LEPR完整编码区,并对序列进行生物信息学分析;构建Ah感染的黑龙江林蛙炎症模型,通过qRT-PCR、免疫组织化学染色和Western印迹等方法,对LEPR在生理状态下及感染状态下不同组织的表达进行动态检测。结果显示,LEPR基因读码框含3 408bp,共编码1 135个氨基酸,其在黑龙江林蛙多个组织中均有表达,心血管表达量最低。在Ah感染下心、肝、脾、肾、皮肤、肌肉和胃LEPR mRNA均在72 h达到表达量峰值(P0.05);脾和皮肤在不同感染时间表达量从高到低为:72 h>对照>36 h,胃在36 h表达量最低(P<0.05)。综上所述,本研究成功克隆了LEPR基因,推断该基因参与了机体的感染过程,为进一步探究LEPR在两栖类的生物学功能奠定基础。

关键词：黑龙江林蛙瘦素受体嗜水气单胞菌炎症反应

黑龙江林蛙ferritin H基因克隆及其在细菌侵染下的表达变化分析

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动物学杂志 2023年第6期58卷 881-890页

作者：刘依铭许冬梅刘思影刘玉芬刘鹏赵文阁陈辉哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025

铁蛋白广泛存在于生物体内,能够使细胞内的铁元素含量保持相对稳定且能参与机体免疫反应。近年来因细菌侵染,黑龙江林蛙(Rana amurensis)种群数量出现下降趋势,本研究探究铁蛋白基因在细菌感染的林蛙中的表达模式,期望可以为黑龙江林蛙... 详细信息

铁蛋白广泛存在于生物体内,能够使细胞内的铁元素含量保持相对稳定且能参与机体免疫反应。近年来因细菌侵染,黑龙江林蛙(Rana amurensis)种群数量出现下降趋势,本研究探究铁蛋白基因在细菌感染的林蛙中的表达模式,期望可以为黑龙江林蛙抗细菌感染的机制研究提供参考。本研究首先采用PCR技术扩增黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因的编码区序列并对其进行生物信息学分析;再应用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测黑龙江林蛙被嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染后,铁蛋白H亚基基因在其肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的转录水平变化情况;最后采用免疫荧光检测技术,分析嗜水气单胞菌侵染后,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基蛋白表达情况。结果表明,该基因编码区长度534 bp,编码177个氨基酸;对该基因氨基酸序列进行分析,其与欧洲林蛙(R.temporaria)相应基因同源性最高,达到98.37%;RT-q PCR结果显示,铁蛋白H亚基基因在黑龙江林蛙组织中广泛存在,在嗜水气单胞菌侵染后,铁蛋白H亚基m RNA在黑龙江林蛙肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的表达均显著上调(P黑龙江林蛙肝和肌肉组织的胞质中均有不同程度表达。综上结果表明,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因会通过上调表达来响应细菌性感染,由此推测该基因参与了黑龙江林蛙的细菌性免疫应答。

关键词：铁蛋白基因黑龙江林蛙嗜水气单胞菌基因克隆细菌感染

脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第7期45卷 744-749页

作者：刘依铭许冬梅楼柏丹刘玉芬刘鹏赵文阁哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨150025

为探究在细菌脂多糖(LPS)诱导下,黑龙江林蛙(Rana amurensis)抗氧化酶活性的变化,以及铁蛋白重链亚基基因(Ferritin-H,Fer-H)参与林蛙机体抗氧化反应的作用机制,本研究以1 m L/只LPS溶液(1 mg/mL)腹腔注射黑龙江林蛙,构建LPS诱导的黑龙... 详细信息

为探究在细菌脂多糖(LPS)诱导下,黑龙江林蛙(Rana amurensis)抗氧化酶活性的变化,以及铁蛋白重链亚基基因(Ferritin-H,Fer-H)参与林蛙机体抗氧化反应的作用机制,本研究以1 m L/只LPS溶液(1 mg/mL)腹腔注射黑龙江林蛙,构建LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型,诱导后各时间点(6 h、24 h、48 h、72 h和120 h)采集组织样品,采用HE染色法观察各组织病变,结果显示,LPS诱导下黑龙江林蛙的肝脏、皮肤以及肌肉组织均出现了损伤,LPS诱导的林蛙炎症模型可以用于后续实验。利用相应的活性测定试剂盒对采集LPS诱导后各时间点林蛙各组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)等抗氧化酶活性检测,同时采用荧光定量PCR检测黑龙江林蛙各组织中Fer-H基因转录水平的变化。抗氧化酶活性检测结果显示,和未加LPS的对照组相比,LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中SOD、CAT的活性均极显著升高(P黑龙江林蛙各组织中的Fer-H基因转录水平均极显著上调(P林蛙的抗氧化应激反应。本研究首次验证了LPS诱导下黑龙江林蛙各组织会出现氧化损伤,并为探究Fer-H基因与两栖类动物抗氧化反应之间的关系奠定了基础。

关键词：黑龙江林蛙脂多糖氧化应激铁蛋白H亚基基因

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黑龙江林蛙胃肠道5-羟色胺细胞的胚后发生

动物学杂志 2015年第4期50卷 635-642页

作者：李淑兰张欣张婷婷哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025

采用亲和素-生物素复合物(ABC)免疫组织化学法,对黑龙江林蛙(Rana amurensis)胚后发育各时期胃肠道中5-羟色胺(5-HT)细胞的发生过程进行了研究。结果显示,黑龙江林蛙胃中的5-羟色胺阳性细胞最早在第38期被检测到,小肠和大肠最早出现在... 详细信息

采用亲和素-生物素复合物(ABC)免疫组织化学法,对黑龙江林蛙(Rana amurensis)胚后发育各时期胃肠道中5-羟色胺(5-HT)细胞的发生过程进行了研究。结果显示,黑龙江林蛙胃中的5-羟色胺阳性细胞最早在第38期被检测到,小肠和大肠最早出现在第41期。从41期开始,5-羟色胺细胞分布于胃、小肠和大肠中,在同一发育时期中,胃部分布密度最大。同一部位在不同发育时期5-羟色胺细胞的分布密度不同,其中胃内5-羟色胺细胞在38期和43期分布最多,分布密度分别为1.8±0.62和1.8±0.89,45期分布数量最少,分布密度为1.1±0.31;小肠中5-羟色胺细胞在41期和43期分布最多,分布密度均为1.2±0.41,在44期和45期分布最少,分布密度分别为0.7±0.49和0.7±0.47;大肠中5-羟色胺细胞在第42期分布最多,分布密度为1.2±0.41,在44期分布最少,分布密度为0.7±0.47。5-羟色胺细胞最早分布在上皮细胞之间,随着胃肠道发育的日渐完善,在上皮基部或腺泡上皮之间也有分布。细胞形态变化不明显,有圆形、椭圆形、锥体形、长梭形和三角形。推测5-羟色胺阳性细胞的出现时间、形态以及分布型是与黑龙江林蛙的个体生长发育需要、胃肠道各段的功能以及食性转变相适应的。

关键词：黑龙江林蛙胃肠道 5-羟色胺细胞胚后发生

LEPR在东北林蛙和黑龙江林蛙抗感染免疫中的作用研究

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LEPR在东北林蛙和黑龙江林蛙抗感染免疫中的作用研究

作者：许冬梅哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

瘦素受体(Leptin receptor,LEPR)是一种跨膜蛋白质,属于I类细胞因子受体家族成员。瘦素受体与瘦素(Leptin,LEP)结合后可以发挥能量代谢、繁殖和免疫等多种重要生物学功能。为了探究LEPR在两栖类炎症反应中的作用,本研究以东北林蛙(Rana ... 详细信息

瘦素受体(Leptin receptor,LEPR)是一种跨膜蛋白质,属于I类细胞因子受体家族成员。瘦素受体与瘦素(Leptin,LEP)结合后可以发挥能量代谢、繁殖和免疫等多种重要生物学功能。为了探究LEPR在两栖类炎症反应中的作用,本研究以东北林蛙(Rana dybowskii)和黑龙江林蛙(Rana amurensis)为实验对象,利用RTPCR技术克隆LEPR基因,对其进行生物信息学分析;再构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染的炎症模型,用常规HE染色法观察炎症模型的病理变化;qRT-PCR检测LEPR基因在Ah感染下两种林蛙体内的动态表达规律;再应用免疫组织化学染色法和Western印迹检测探究在Ah感染下LEPR蛋白定位和表达规律。获得结果如下:经RT-PCR获得东北林蛙和黑龙江林蛙LEPR基因的编码区,分别为3 405 bp和3 408 bp,编码1 134和1 135个氨基酸残基,黑龙江林蛙LEPR蛋白在第1 111处增加一个赖氨酸。二者LEPR均为亲水性不稳定蛋白质,具有一次跨膜结构的细胞膜蛋白。核苷酸同源性分析表明两者同源性为97.1%,系统进化关系分析显示这两种林蛙LEPR在亲缘关系上与两栖动物聚为一支,表明LEPR保守程度较高。随细菌感染时间增加,肝脏、脾脏、皮肤、肌肉和胃组织中均出现了不同程度的病理变化。肝脏组织细胞间隙增大,细胞的边界模糊,细胞核出现固缩;脾脏细胞出现溶血,黑色素巨噬细胞增多;皮肤表皮层破损,真皮层发生溶解变薄,黑色素细胞增加;肌肉组织中肌纤维间距变宽、崩解和断裂;胃粘膜上皮组织出现破损溶解,粘膜下层血管出现淤血,血细胞充满在固有层和粘膜下层,表明炎症感染模型成功建立。qRT-PCR实验结果表明,在Ah感染不同时间点,两种林蛙心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾、皮肤、肌肉和胃组织中LEPR m RNA表达量均有不同程度上调。其中东北林蛙肺脏、肾脏、肌肉和胃中LEPR m RNA表达量在16 h达到峰值,而脾脏和皮肤在72 h达到峰值,心脏和肝脏分别在24 h和8 h达到峰值;黑龙江林蛙肺脏组织中LEPR m RNA在感染8 h达到峰值,其余检测组织均在感染72 h表达量达到峰值。免疫组织化学染色和Western印迹检测结果表明,Ah感染下两种林蛙的肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和胃中LEPR蛋白质表达与qRT-PCR检测LEPR m RNA表达量的趋势基本一致,LEPR主要定位在细胞膜上。综上,本研究获得了东北林蛙和黑龙江林蛙LEPR基因,对两者的生物学基本特性进行了分析。确定了该基因参与嗜水气单胞菌感染的全过程,为进一步分析LEPR基因在两栖类的生物学功能奠定了基础。

关键词：嗜水气单胞菌东北林蛙黑龙江林蛙瘦素受体表达特征

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黑龙江林蛙胃肠道嗜银细胞的胚后发生

黑龙江畜牧兽医 2015年第12期 220-222,318,319页

作者：张婷婷张欣李淑兰哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025

为了探究嗜银细胞在黑龙江林蛙胃肠道胚后发育过程中的演变规律,试验采用Grimelius法对黑龙江林蛙胚后发育各时期胃肠道中嗜银细胞的发生过程进行了研究。结果表明:嗜银细胞最早出现在第38期胃黏膜上皮之间,小肠中嗜银细胞最先出现在第4... 详细信息

为了探究嗜银细胞在黑龙江林蛙胃肠道胚后发育过程中的演变规律,试验采用Grimelius法对黑龙江林蛙胚后发育各时期胃肠道中嗜银细胞的发生过程进行了研究。结果表明:嗜银细胞最早出现在第38期胃黏膜上皮之间,小肠中嗜银细胞最先出现在第42期,随着胃肠道发育的逐渐完善,其分布的位置及形态也有所不同,嗜银细胞的分布位置由初始时的上皮细胞之间到腺泡上皮之间变化,细胞形态也由闭合型细胞到开放型细胞转变。推测嗜银细胞的发生时间与蝌蚪的进食及生长发育的需要有关,其分布位置和形态与嗜银细胞的功能有关。

关键词：黑龙江林蛙胃肠道嗜银细胞胚后发生分布位置

瘦素及LepROT在两种林蛙抗感染中的作用研究

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瘦素及LepROT在两种林蛙抗感染中的作用研究

作者：吴彤哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

为了获得瘦素(Leptin,LEP)和瘦素受体叠加转录蛋白(Leptin receptor overlapping transcript,LepROT)以及核转录因子(Nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)信号通路在两栖类抗感染中的作用及其机制的相关信息,本研究采用RTPCR技术克隆黑龙江林蛙(Rana amurensis)及东北林蛙(R.dybowskii)的Leptin和LepROT基因并进行生物信息学分析;构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)与细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)胁迫下黑龙江林蛙及东北林蛙的感染模型,观察病理解剖变化特征;应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Leptin、LepROT和NF-κB的动态表达规律;应用免疫荧光检测技术获得Leptin、LepROT和NF-κB的蛋白表达变化,其主要结果如下:1.克隆黑龙江林蛙和东北林蛙的Leptin、LepROT基因全长编码区,瘦素基因产物长度分别为857 bp和845 bp,均编码173个氨基酸残基,二者核苷酸同源性为96.36%;LepROT基因产物长度均为396 bp,可编码131个氨基酸,核苷酸同源性为96.72%。LepROT在不同物种间保守程度较高,而Leptin基因相对较低。2.构建瘦素基因的重组原核表达载体,诱导重组蛋白的大小为37 KD,免疫家兔后获得多克隆抗体效价为1:20000。3.成功构建Ah和LPS感染模型,对黑龙江林蛙炎症模型的组织切片进行HE染色。发现随着感染时间的延长,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃组织均出现组织病变现象。4.采用qRT-PCR技术检测实验组和对照组两种林蛙各组织中Leptin、LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβm RNA相对表达量的变化。5.免疫荧光检测技术分析发现在Ah和LPS胁迫下两种林蛙肺脏、肾脏、肌肉和胃中瘦素、LepROT和NF-κB分子的表达与qRT-PCR各时间点表达量的趋势基本一致。

关键词：黑龙江林蛙东北林蛙瘦素瘦素受体叠加转录蛋白嗜水气单胞菌

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黑龙江林蛙卵中粗多糖提取工艺的研究

时珍国医国药 2014年第2期25卷 328-329页

作者：刘娟李凤伟王超佳木斯大学药学院黑龙江佳木斯154007

目的研究黑龙江林蛙卵中粗多糖的提取工艺条件。方法采用超声法提取黑龙江林蛙卵中的粗多糖,考察了超声时间、料液比、超声前加热时间、超声温度4个因素对蛙卵中粗多糖含量的影响,通过单因素试验和正交试验确定了提取的最佳工艺条件。... 详细信息

目的研究黑龙江林蛙卵中粗多糖的提取工艺条件。方法采用超声法提取黑龙江林蛙卵中的粗多糖,考察了超声时间、料液比、超声前加热时间、超声温度4个因素对蛙卵中粗多糖含量的影响,通过单因素试验和正交试验确定了提取的最佳工艺条件。结果最佳提取工艺参数为:超声时间10 min,液料比40 ml/g,超声前加热时间50 min,超声温度68℃。结论该方法操作简单,提取时间短,重现性好,对进一步的工艺开发有较好的参考价值。

关键词：黑龙江林蛙林蛙卵多糖提取超声提取工艺

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黑龙江林蛙ISSR反应体系的建立与优化

东北农业大学学报 2012年第6期43卷 121-125页

作者：杨洪雁张宜强杜智恒白秀娟东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030

以黑龙江林蛙为材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,对引物的最佳退火温度进行选择,建立适合黑龙江林蛙的ISSR-PCR分析的最佳体系:在25μL总体积中,包含10×PCR Buff... 详细信息

以黑龙江林蛙为材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,对引物的最佳退火温度进行选择,建立适合黑龙江林蛙的ISSR-PCR分析的最佳体系:在25μL总体积中,包含10×PCR Buffer 2.5μL,Mg2+4.0 mmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,引物0.3μmol.L-1,TaqDNA聚合酶0.5 U,DNA模板2.0 ng.μL-1,最佳退火温度53.8℃。为利用该技术对黑龙江林蛙遗传多样性分析和构建遗传图谱提供一定的依据。

关键词：黑龙江林蛙正交设计体系优化 ISSR-PCR体系