瘦素及LepROT在两种林蛙抗感染中的作用研究

作     者：吴彤 

作者单位：哈尔滨师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵文阁;刘玉芬

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：黑龙江林蛙 东北林蛙 瘦素 瘦素受体叠加转录蛋白 嗜水气单胞菌 

摘      要：为了获得瘦素(Leptin,LEP)和瘦素受体叠加转录蛋白(Leptin receptor overlapping transcript,LepROT)以及核转录因子(Nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)信号通路在两栖类抗感染中的作用及其机制的相关信息,本研究采用RTPCR技术克隆黑龙江林蛙(Rana amurensis)及东北林蛙(R.dybowskii)的Leptin和LepROT基因并进行生物信息学分析;构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)与细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)胁迫下黑龙江林蛙及东北林蛙的感染模型,观察病理解剖变化特征;应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Leptin、LepROT和NF-κB的动态表达规律;应用免疫荧光检测技术获得Leptin、LepROT和NF-κB的蛋白表达变化,其主要结果如下:1.克隆黑龙江林蛙和东北林蛙的Leptin、LepROT基因全长编码区,瘦素基因产物长度分别为857 bp和845 bp,均编码173个氨基酸残基,二者核苷酸同源性为96.36%;LepROT基因产物长度均为396 bp,可编码131个氨基酸,核苷酸同源性为96.72%。LepROT在不同物种间保守程度较高,而Leptin基因相对较低。2.构建瘦素基因的重组原核表达载体,诱导重组蛋白的大小为37 KD,免疫家兔后获得多克隆抗体效价为1:20000。3.成功构建Ah和LPS感染模型,对黑龙江林蛙炎症模型的组织切片进行HE染色。发现随着感染时间的延长,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃组织均出现组织病变现象。4.采用qRT-PCR技术检测实验组和对照组两种林蛙各组织中Leptin、LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβm RNA相对表达量的变化。5.免疫荧光检测技术分析发现在Ah和LPS胁迫下两种林蛙肺脏、肾脏、肌肉和胃中瘦素、LepROT和NF-κB分子的表达与qRT-PCR各时间点表达量的趋势基本一致。