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苹果坏死花叶病毒烟台分离物的鉴定与序列分析

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中国果树 2021年第9期 42-47,51,I0002页

作者：弟豆豆宋来庆曹晓敏胡慧张硕张学勇姜中武赵玲玲烟台市农业科学研究院山东265500 烟台大学生命科学学院

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对在山东省烟台市采集的31份表现花叶症状的苹果幼叶进行了苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)和苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)检测。结果表明,ApNMV的检出率为87.1%,A... 详细信息

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对在山东省烟台市采集的31份表现花叶症状的苹果幼叶进行了苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)和苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)检测。结果表明,ApNMV的检出率为87.1%,ApMV未检出,表明ApNMV与烟台地区苹果花叶病高度相关。从‘红将军’苹果和‘长富2号’苹果花叶样品中分别克隆出2条ApNMVRNA3基因组序列,GenBank登录号分别为MN911185和MN911186,这2条分离物核苷酸序列长度分别为1783 nt和1785 nt。序列比对结果显示,2条分离物核苷酸序列相似性为91.71%,与已报道的ApNMV RNA3核苷酸序列一致性为89.88%~96.64%。系统进化分析显示,不同来源的ApNMV亲缘关系较近,分离物之间没有表现出寄主特异性和地域分布规律。研究结果为该病的防治、流行规律的判断以及致病机理研究提供了理论依据。

关键词：苹果花叶病苹果坏死花叶病毒序列分析

苹果坏死花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

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中国果树 2021年第5期 13-17页

作者：胡国君张尊平范旭东任芳马勉娣张秀英鲁兴凯董雅凤中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心辽宁兴城125100 昭通市苹果产业发展中心

根据GenBank数据库已登录序列设计了12对苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)的检测引物,通过引物筛选和体系优化,建立了以ApN1-F3/R3为引物的ApNMV的TB Green染料法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.3%,相关系数为0.997,灵敏度是常规PCR的100倍。采用q PCR方法对60份田间苹果样品进行检测,结果显示,常规PCR对ApNMV的检出率为51.7%,而qPCR的检出率为56.7%。该技术适用于田间样品的检测。

关键词：苹果苹果坏死花叶病毒实时荧光定量PCR 常规PCR

苹果坏死花叶病毒烟台分离物的鉴定与表达特性分析

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苹果坏死花叶病毒烟台分离物的鉴定与表达特性分析

作者：弟豆豆烟台大学

学位级别：硕士

我国是世界最大的苹果生产国,苹果栽培面积、总产量以及消费量居世界首位。苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害,在全国普遍发生,导致果实的品质和产量下降,给苹果产业带来巨大的经济损失。最新的研究表明,苹果花叶病毒（ApMV）... 详细信息

我国是世界最大的苹果生产国,苹果栽培面积、总产量以及消费量居世界首位。苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害,在全国普遍发生,导致果实的品质和产量下降,给苹果产业带来巨大的经济损失。最新的研究表明,苹果花叶病毒（ApMV）不是苹果花叶病的唯一病原,李属坏死环斑病毒（PNRSV）和苹果坏死花叶病毒（ApNMV）也是苹果花叶病的病原。迄今为止,NCBI共登录10条ApNMV RNA3基因组序列,其中包括1个来自日本的分离株和来自中国的9个分离株。而关于山东烟台市ApNMV分离物的研究尚未见报道。本研究调查了烟台地区苹果花叶病植株病毒的带毒情况,克隆了富士和红将军上ApNMV RNA3全长序列,分析了其基因组结构、分类地位和分子进化关系。检测了其时空表达差异,并分析了苹果、梨和月季上ApNMV的序列差异,以期为该病的防治、流行规律的判断以及致病机理研究提供理论依据。主要内容如下:1、检测了烟台市31份苹果花叶样品的带毒情况,花叶样品中ApNMV检出率为87.1%,用ApMV和PNRSV的特异引物并未扩增出目的条带,说明ApNMV与烟台地区苹果花叶病症状相关。对苹果上广泛存在的3种潜隐性病毒ASGV、ACLSV、ASPV和1种非潜隐性病毒ASSVd进行了检测,发现这4种病毒与ApNMV混合侵染率高达96.3%。2、采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,分别在烟台地区鉴定到海棠（H281）、梨（L16）、月季（Y6）花叶样品中获得3条440nt左右的ApNMV目的片段。将海棠（H281）、梨（L16）、月季（Y6）测序结果与富士苹果中目的片段（F411）在DNAMAN中进行序列多重比对,结果表明,获得的3条海棠（H281）、梨（L16）、月季（Y6）分离物的相似性为93.78%,这3条片段与富士上序列的一致性分别为89.74%、90.58%、90.87%。系统进化分析结果表明,富士苹果（F411）与月季（Y6）进化关系最近,和梨（L16）关系较近,聚于同一分支;海棠单独聚于一分支。表明ApNMV与海棠、梨、月季中花叶病症状有关。3、分别在具有花叶症状的红将军和富士苹果叶片鉴定出苹果环斑花叶病毒（ApNMV）YF31和YF515 2条长度为1785nt和1783nt的RNA3基因组全长序列,GenBank登陆号分别为MN911185和MN911186。序列分析结果表明,所扩增的YF515和YF31均在5’UTR有约180个碱基的缺失,序列变异较大;IR区与登录序列核苷酸一致性仅为58.39-91.26%,编码区MP、CP核酸序列一致性分别为89.09%-97.52%,89.85%-96.21%;氨基酸序列一致性分别为91.79%-98.21%,90.02%-95.43%。系统进化分析表明,分离物之间没有表现出寄主特异性和地域分布规律。以邻接法构建基于氨基酸水平和核酸水平上的ApNMV分离物与Bromoviridae科其它病毒的系统发育树,结果显示,获得的2条ApNMV分离物在分类地位上属于雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属第3亚组,与ApMV和PNRSV具有同源性,与其核苷酸一致性分别为47.28-47.77%,54.7-55.61%。将其与GenBank中登录的ApNMV、APMV和PNRSV的MP和CP序列构建系统进化树,进一步明确了ApNMV、ApMV和PNRSV进化上的差异性。4、以携带ApNMV的富士苹果树为试材,利用实时荧光定量PCR方法对不同部位、不同时间采集的样品进行ApNMV定量检测,表明环斑花叶病毒在树体内的时空分布存在差异:ApNMV在苹果植株中的相对含量由高到低依次为:芽、根、枝皮、叶片。8月15日至12月15日,9月15日ApNMV的相对含量最高,病毒相对含量最高,此后病毒相对含量下降。

关键词：苹果花叶病苹果坏死花叶病毒序列分析时空分布

河北苹果坏死花叶病毒的发生及近全基因组序列的测定与分析

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河北农业大学学报 2023年第1期46卷 72-79页

作者：董震杨李紫腾胡同乐王树桐王亚南曹克强河北农业大学植物保护学院河北保定071001

为明确苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)在河北的发生及其基因组特性,本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测,然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明,河北农大果园‘... 详细信息

为明确苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)在河北的发生及其基因组特性,本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测,然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明,河北农大果园‘红珍珠’‘锦锈红’‘信侬红’3个品种及保定唐县苹果实验基地富士品种ApNMV检出率分别为9.09%、18.18%、100%和65%。ApNMV阳性果树高通量测序结果显示,果树为ApNMV、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)复合侵染,ApNMV河北分离物(ApNMV-HB)的近全基因组序列包含RNA1~RNA3序列,GenBank登录号分别为OP019626、OP019627和OP019628。RNA1编码120 kD的甲基转移酶/NTP-binding解旋酶(MET/HEL),RNA2编码97 kD的RNA聚合酶(POL),RNA3编码运动蛋白(Movement protein, MP)和外壳蛋白(Coatprotein,CP),4个基因核苷酸和氨基酸序列与代表性分离物相似性分别为89.44%~97.02%、92.14%~98.67%。系统发育关系分析表明,以ApNMV RNA1、RNA2、RNA3(CP和MP)编码的氨基酸为基础构建系统发育树,ApNMV-HB分别与AM95、AM125、XJ、ZZ亲缘关系最近。本研究首次揭示了ApNMV河北分离物的近全基因组序列,丰富了该病毒的基因组序列信息,明确了该分离物与其它分离物的系统发育关系,为进一步了解该病毒的系统发育及遗传进化提供参考。

关键词：苹果坏死花叶病毒高通量测序基因组特性系统进化

内蒙古呼和浩特地区苹果坏死花叶病毒的检测与遗传多样性研究

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中国果树 2020年第3期 39-42,I0004页

作者：李正男张磊耿帅鑫马强李小燕孙平平内蒙古农业大学园艺与植物保护学院呼和浩特010018

采用RT-PCR方法对从内蒙古呼和浩特地区采集的29份表现花叶症状的海红果(Malus micromalus Makino)叶片样品进行了苹果坏死花叶病毒(ApNMV)的检测,ApNMV的检出率为100%,说明ApNMV在呼和浩特地区表现花叶症状的海红果上普遍发生。分别克... 详细信息

采用RT-PCR方法对从内蒙古呼和浩特地区采集的29份表现花叶症状的海红果(Malus micromalus Makino)叶片样品进行了苹果坏死花叶病毒(ApNMV)的检测,ApNMV的检出率为100%,说明ApNMV在呼和浩特地区表现花叶症状的海红果上普遍发生。分别克隆并测序了29份海红果样品中ApNMV的全长外壳蛋白(CP)基因,结果表明,29个ApNMV分离物CP基因间核苷酸序列一致性为94.1%~99.8%,与NCBI数据库中其他19个ApNMV分离物全长CP基因核苷酸一致性为86.1%~97.1%。利用ApNMV CP基因的全长序列构建了系统发育树,48个ApNMV分离物共分成5个组,本研究中的29个ApNMV分离物与2个日本分离物LC108995和NC040470聚集在一起,形成组Ⅰ;其余ApNMV分离物分别形成了组Ⅱ~组Ⅴ。

关键词：海红果苹果坏死花叶病毒 RT-PCR 外壳蛋白

在我国山西和甘肃地区首次检测到苹果坏死花叶病毒

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在我国山西和甘肃地区首次检测到苹果坏死花叶病毒

中国植物病理学会第十二届青年学术研讨会

作者：谢吉鹏龚卓群陈冉冉国立耘李世访周涛中国农业大学植物病理学系农业部植物病理学重点实验室中国农业科学院植物保护研究所

我国是世界苹果生产第一大国,病毒病普遍发生,严重影响我国苹果生产品质和效益,其中苹果花叶病是我国大部分苹果产区常见的一种病毒病。在山西和甘肃地区分别采集了花叶和无花叶症状的苹果叶片样品,其中山西样品中花叶症状20份,无花叶症... 详细信息

我国是世界苹果生产第一大国,病毒病普遍发生,严重影响我国苹果生产品质和效益,其中苹果花叶病是我国大部分苹果产区常见的一种病毒病。在山西和甘肃地区分别采集了花叶和无花叶症状的苹果叶片样品,其中山西样品中花叶症状20份,无花叶症状4份;甘肃样品中花叶症状10份,无花叶症状16份。所采集的花叶样品症状主要表现为沿叶脉褪绿黄化,叶脉间多为小黄斑或褐色环斑。提取花叶样品和无花叶样品组织总RNA,通过RT-PCR检测,以苹果坏死花叶病毒（Apple necrotic mosaic virus,ApNMV）的特异性引物扩增得到640 bp的目标片段。在山西和甘肃的30份花叶样品中,ApNMV阳性样品数为25,阳性率为83.3%;在20份无花叶样品中,ApNMV阳性样品数为6,阳性率为30.0%。

关键词：苹果花叶病苹果坏死花叶病毒病毒检测 RT-PCR

来源： cnki会议评论

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中国苹果花叶病病原研究现状分析

果树学报 2020年第12期37卷 1953-1963页

作者：邢飞王红清李世访中国农业科学院植物保护研究所·植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 中国农业大学园艺学院北京100193

我国是世界上最大的苹果生产国,苹果花叶病是苹果栽培中最常见的病毒性病害,在我国各大苹果产区发生普遍。感病苹果叶片常表现花叶、坏死、沿脉形成不均匀分布的条纹等症状,栅栏组织细胞排列松散、叶绿体畸变、膜结构遭到破坏,最终影响... 详细信息

我国是世界上最大的苹果生产国,苹果花叶病是苹果栽培中最常见的病毒性病害,在我国各大苹果产区发生普遍。感病苹果叶片常表现花叶、坏死、沿脉形成不均匀分布的条纹等症状,栅栏组织细胞排列松散、叶绿体畸变、膜结构遭到破坏,最终影响叶片光合能力和果实品质形成,严重威胁苹果产业的可持续健康发展。近年来的研究表明,从感花叶病苹果叶片中新鉴定的苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)与我国苹果表现花叶病的相关性较高,可能是引起我国苹果花叶病的主要病原。但也有研究指出,同属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)的苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)也被认为可能是引起我国苹果花叶病的重要病原。为此,笔者依据前人研究基础及本研究室前期研究结果,系统综述了ApNMV与我国苹果花叶病的关系及其研究进展,并分析了ApMV和PNRSV在我国表现苹果花叶病的苹果样品中的侵染状况,旨在进一步明确引起我国苹果花叶病的主要病原,为该病害的科学防控提供参考。

关键词：苹果花叶病苹果坏死花叶病毒苹果花叶病毒李属坏死环斑病毒

3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立

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河北农业大学学报 2024年第5期47卷 84-92页

作者：李紫腾潘媛马子文胡同乐王树桐曹克强王亚南河北农业大学植物保护学院河北保定071001

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。

关键词：苹果茎沟病毒苹果茎痘病毒苹果坏死花叶病毒荧光定量RT-PCR检测体系

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5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

中国果树 2023年第10期 79-83,88页

作者：胡国君范旭东李军任芳孙喜陈张尊平董雅凤中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心辽宁兴城125100 辽宁省绿色农业技术中心

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNM... 详细信息

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。

关键词：苹果苹果褪绿叶斑病毒苹果茎沟病毒苹果茎痘病毒苹果坏死花叶病毒苹果锈果类病毒多重PCR