苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

作     者：邢飞 王红清 李世访 XING Fei;WANG Hongqing;LI Shifang

作者机构：中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 中国农业大学园艺学院北京100193 

出 版 物：《西南大学学报（自然科学版）》 (Journal of Southwest University(Natural Science Edition))

年 卷 期：2024年第46卷第4期

页      面：63-69页

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(31872922) 

主　　题：苹果坏死花叶病毒 外壳蛋白基因 原核表达 抗血清 酶联免疫吸附分析方法 

摘      要：苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.