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斑马鱼胆汁酸稳态调控研究方法的建立

斑马鱼胆汁酸稳态调控研究方法的建立

作者：姜鹏飞西南大学

学位级别：硕士

胆汁酸是以胆固醇为原料在肝脏内合成的两亲性分子,其主要生理功能是帮助膳食脂类和脂溶性维生素的消化和吸收。胆汁酸合成后通过胆汁酸输出泵运出肝细胞进入胆管,随后储存于胆囊中。进食后胆囊收缩释放胆汁流入肠道,绝大部分胆汁酸在... 详细信息

胆汁酸是以胆固醇为原料在肝脏内合成的两亲性分子,其主要生理功能是帮助膳食脂类和脂溶性维生素的消化和吸收。胆汁酸合成后通过胆汁酸输出泵运出肝细胞进入胆管,随后储存于胆囊中。进食后胆囊收缩释放胆汁流入肠道,绝大部分胆汁酸在回肠被重吸收通过门静脉运送回肝脏,少量随粪便排出,这一过程称为胆汁酸的肝肠循环。胆汁酸的合成、转运与排泄调控胆汁酸总量的平衡称为胆汁酸稳态,主要通过位于肝脏和肠道的特定受体及转运蛋白对胆汁酸合成、转运进行严格调控来维持。其中胆汁酸直接激活的核受体FXR起着关键作用,激活的FXR会抑制胆汁酸的合成,诱导胆汁酸转运蛋白的表达。胆汁酸合成、转运相关基因的功能受损或缺失会导致胆汁酸稳态失衡。胆汁酸稳态调控的研究主要以小鼠为模型,取得了诸多成就,但是小鼠并不能完全模拟人类胆汁酸稳态调控的所有特征,如Abcb11基因敲除的小鼠表现出轻度胆汁淤积,这与人类ABCB11基因突变导致Ⅱ型进行性家族性胆汁淤积的重度胆汁淤积并不相符,因此利用其他模式生物开展胆汁酸稳态调控研究或能拓展我们的认识。斑马鱼作为研究肝脏发育与疾病的模式生物,其优势包括养殖方便、胚胎体外受精且透明、产卵量大、易于进行遗传操作等。近年来在斑马鱼中成功模拟了Ⅱ型进行性家族性胆汁淤积、胆道闭锁等疾病,克服了啮齿动物模型不能完全模拟病人特征的局限性,为胆汁酸相关疾病发病机制带来了新的认识,这些研究表明在斑马鱼中开展胆汁酸相关研究是可行的。小鼠中胆汁酸稳态调控的研究方法分为遗传学方法和非遗传学方法,遗传学方法如构建突变体研究相关基因的功能;非遗传学方法如喂食哺乳动物胆汁酸,以胆汁酸反馈抑制通路是否被激活为评价标准。斑马鱼中能够实现相关技术操作,但这些方法是否适用于斑马鱼胆汁酸稳态调控的研究尚不清楚。为了在斑马鱼中建立胆汁酸稳态调控的研究方法,我们参考小鼠中的研究思路,使用哺乳动物胆汁酸成分处理斑马鱼,检测胆汁酸反馈抑制通路是否被激活。首先,我们鉴定了小鼠胆汁酸反馈抑制通路中的Shp、Cyp7a1在斑马鱼中的同源基因分别是nr0b2a、cyp7a1。随后,使用不同浓度的哺乳动物胆汁酸组分CA、CDCA或UDCA处理受精后3.5天的斑马鱼胚胎,处理至受精后7.5天进行数据分析。q PCR结果显示,CDCA或UDCA处理不能激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路,而CA处理可以激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路。进一步的研究表明,CA处理会抑制胆汁酸合成基因cyp7a1、cyp8b1、cyp27a1的表达,同时诱导肠道中的胆汁酸转运蛋白slc51a、slc10a2的表达,这与小鼠中喂食CA后的胆汁酸稳态调控相似,表明哺乳动物胆汁酸CA能够调控斑马鱼胆汁酸稳态基因的表达。我们还使用鱼类的胆汁开展实验。斑马鱼属于鲤科,鲤鱼相比斑马鱼其胆汁量大且易获得,于是我们使用不同浓度的鲤鱼胆汁处理斑马鱼探究能否影响胆汁酸稳态。q PCR结果显示,在保证幼鱼存活的前提下,鲤鱼胆汁处理不能激活斑马鱼胆汁酸反馈抑制通路,我们猜测可能原因是鲤鱼胆汁中蕴含的有毒成分所致。之后,我们使用成年斑马鱼胆汁开展实验,发现斑马鱼胆汁处理能够激活胆汁酸反馈抑制通路,且上调肝内主要的胆汁酸转运蛋白的表达,这与生理条件下肝内胆汁酸水平升高时的特征相似。为了探究斑马鱼胆汁处理后肝内胆汁酸水平是否升高,我们检测了全胚组织和除肝脏外的躯体中总胆汁酸水平,其结果一定程度上印证了这一猜想,这表明斑马鱼胆汁处理能够调控胆汁酸稳态调控基因的表达。此外,我们还从遗传学角度出发,利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中成功敲除了nr0b2a和cyp7a1基因。表型分析发现nr0b2a突变体中cyp7a1的表达升高,cyp7a1突变体中总胆汁酸水平显著降低,这与小鼠中相应突变体的表型相像。这证明了nr0b2a、cyp7a1很可能是小鼠Shp、Cyp7a1的同功基因,进一步表明CA及斑马鱼胆汁处理后检测这两个基因的相对表达量是合理的。FXR在胆汁酸稳态调控中扮演了关键作用,我们成功敲除了小鼠Fxr在斑马鱼中的同源基因nr1h4,并且对突变体进行表型分析,我们发现突变体中fxr的靶基因abcb11b和slc51a的表达显著下调,这与小鼠中的表型相似,这证明了nr1h4很可能是小鼠Fxr的同功基因。使用CA处理fxr突变体后,与对照组相比,实验组中胆汁酸合成基因与胆汁酸转运基因的表达并无明显差异,这证明CA处理对胆汁酸稳态的调控是fxr依赖性的。CA及斑马鱼胆汁处理的结果与nr0b2a、cyp7a1和fxr突变体表型分析的结果均表明:我们的研究方法可用于斑马鱼胆汁酸稳态调控研究。除了与小鼠胆汁酸稳态调控相一致的结果外,我们还发现使用CA或斑马鱼胆汁处理野生型斑马鱼胚胎后,其肝内胆管变粗,这暗示着使用CA或斑马鱼胆汁处理后,胆管内胆汁流可能增大,肝内胆汁酸水平

关键词：斑马鱼胆酸斑马鱼胆汁胆汁酸稳态

ANIT诱导的胆汁淤积型肝损伤中的胆汁酸稳态失衡及其机制研究

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ANIT诱导的胆汁淤积型肝损伤中的胆汁酸稳态失衡及其机制研究

二苯乙烯苷扰乱胆汁酸平衡并抑制磷脂分泌诱导肝损伤

2016年第六届全国药物毒理学年会

作者：杨婷婷江振洲张陆勇中国药科大学江苏省新药筛选重点实验室中国药科大学江苏省药效研究与评价服务中心中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室

＜正＞目的:胆汁酸是胆汁的主要成分,机体内胆汁酸的稳态与肝、肠及胆道系统密切相关,有研究表明胆汁酸可作为胆汁淤积性肝损伤类疾病潜在的生物标志物。本课题以毒代动力学及代谢组学为研究手段,对α-异硫氰酸萘酯（ANIT）诱导的胆汁... 详细信息

＜正＞目的:胆汁酸是胆汁的主要成分,机体内胆汁酸的稳态与肝、肠及胆道系统密切相关,有研究表明胆汁酸可作为胆汁淤积性肝损伤类疾病潜在的生物标志物。本课题以毒代动力学及代谢组学为研究手段,对α-异硫氰酸萘酯（ANIT）诱导的胆汁淤积模型中的胆汁酸进行代谢轮廓分析,研究胆汁淤积模型下胆汁酸代谢谱的变化规律,结合病理学观察、生化指标检测,以内源性小分子化合物胆汁酸为出发点,揭示在胆汁淤积性肝损伤进程中的胆汁酸稳态的变化和作用,为临床

关键词：胆汁淤积型肝损伤 α-异硫氰酸萘酯胆汁酸稳态失衡机制生化指标

来源： cnki会议评论

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中国中药杂志 2021年第1期46卷 139-145页

作者：孙萌俞沁玮向婷江振洲张陆勇中国药科大学江苏省新药筛选重点实验室江苏南京210009 广东药科大学新药研发中心广东广州510006

何首乌是中国传统的中草药之一,被报道具有生发乌发、改善血脂、抗炎及抗衰老等生理活性,然而近年来何首乌诱发的肝损伤引起了广泛关注。二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystibane-2-O-β-D-glucoside,TSG)为何首乌主要成分之一,但其在... 详细信息

何首乌是中国传统的中草药之一,被报道具有生发乌发、改善血脂、抗炎及抗衰老等生理活性,然而近年来何首乌诱发的肝损伤引起了广泛关注。二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystibane-2-O-β-D-glucoside,TSG)为何首乌主要成分之一,但其在何首乌肝损伤中的作用尚不清楚。该研究主要考察二苯乙烯苷诱发的肝损伤及其对胆汁酸平衡和磷脂分泌的影响。C57BL/6J小鼠腹腔注射400 mg·kg^(-1)TSG,检测肝损伤生化指标及磷脂含量的变化并采用LC-MS/MS技术检测胆汁酸成分的变化。结果显示,腹腔注射400 mg·kg^(-1)TSG显著升高血清总胆汁酸(total bile acid,TBA)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平并显著升高游离胆汁酸含量,包括血清中的β-鼠胆酸(β-muricholic acid,β-MCA)、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)、猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)、去氧胆酸(deoxcholic acid,DCA)及肝脏中的β-MCA和CDCA;相关机制研究表明TSG可显著抑制法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)及下游胆酸盐外排转运蛋白(bile salt export pump,BSEP)表达导致胆汁酸蓄积,同时TSG还可抑制胆固醇25α7羟化酶(25-hydroxycholesterol-7alpha-hydroxylase,CYP7B1)干扰胆汁酸合成替代途径。另外,腹腔注射400 mg·kg^(-1)TSG还显著降低胆汁中磷脂含量,进一步研究发现TSG显著抑制磷脂转运蛋白多药耐药蛋白2(multidrug resistance protein 2,MDR2)的表达并破坏肝脏胆管膜上MDR2的规则分布;体外结果显示TSG在HepG2细胞上的半抑制浓度约为1500μmol·L^(-1),在HepG2细胞上500μmol·L^(-1)TSG作用24 h可破坏胆管膜上MDR2的规则分布。综上,TSG可通过扰乱胆汁酸稳态和抑制磷脂分泌诱导肝损伤。

关键词：二苯乙烯苷胆汁酸稳态磷脂分泌肝损伤

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胆汁酸的营养生理作用及代谢调控研究进展

动物营养学报 2019年第5期31卷 2002-2011页

作者：王朋林森吴德方正锋四川农业大学动物营养研究所教育部动物抗病营养重点实验室成都611130

胆汁酸(BA)是由胆固醇在肝脏代谢产生的具有两性分子结构的化合物,对营养物质的消化吸收代谢和动物健康均有重要作用。一方面,BA通过其洗涤特性促进食物中脂类和脂溶性维生素的消化吸收,同时,BA还可以激活法尼醇X受体(FXR)、G蛋白偶联B... 详细信息

胆汁酸(BA)是由胆固醇在肝脏代谢产生的具有两性分子结构的化合物,对营养物质的消化吸收代谢和动物健康均有重要作用。一方面,BA通过其洗涤特性促进食物中脂类和脂溶性维生素的消化吸收,同时,BA还可以激活法尼醇X受体(FXR)、G蛋白偶联BA受体1(GPBAR1)和维生素D受体(VDR),从而在糖代谢、脂类代谢、免疫调节和BA稳态调节方面发挥重要作用;另一方面,由于高浓度的BA特别是疏水性强的BA表现出细胞毒性,妊娠期肝脏内胆汁淤积被认为是导致胎儿宫内发育迟缓、宫内窘迫症、早产甚至死亡的重要因素。本文简要介绍了BA的分类、BA的营养生理功能、BA稳态及营养对BA稳态的调节,以期为动物营养研究及动物生产调控提供新的视觉和参考。

关键词：胆汁酸糖代谢脂代谢胎儿存活胆汁酸稳态营养

EGCG抑制胆汁酸和脂质吸收缓解小鼠代谢异常和脂肪肝的研究

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EGCG抑制胆汁酸和脂质吸收缓解小鼠代谢异常和脂肪肝的研究

作者：万蓓安徽农业大学

学位级别：硕士

随着人们生活水平的提高,饮食结构的改变,代谢性疾病的发病率逐年上升,该类疾病的预防与治疗已成为食品营养领域的研究热点。作为一种健康饮品,茶叶的保健功效已被大量报道,其缓解代谢综合征的机制也得到众多研究者的广泛关注。表没食... 详细信息

随着人们生活水平的提高,饮食结构的改变,代谢性疾病的发病率逐年上升,该类疾病的预防与治疗已成为食品营养领域的研究热点。作为一种健康饮品,茶叶的保健功效已被大量报道,其缓解代谢综合征的机制也得到众多研究者的广泛关注。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中含量最高且功效较强的一种活性物质,具有缓解代谢异常和脂肪肝的显著功效,但其作用机制尚不明确。本论文基于前期研究,以高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠为模型,利用脂质代谢组学的方法探讨了EGCG干预对动物血清和肝脏脂质成分的影响,初步阐明胆汁酸平衡在EGCG缓解动物代谢异常过程中的作用机制。选取7周龄雄性C57BL/6J小鼠50只,随机分为3组:低脂组(低脂低糖饲料,n=10,LF)、高脂组(高脂模型饲料,n=20,HFW)和EGCG处理组(高脂模型饲料+3.2 g/kg EGCG,n=20,HFWE),实验周期为17周。实验期间小鼠自由饮食饮水,每周监测体重及摄食量,每4周测定小鼠血糖及采集尾静脉血,主要试验结果如下:1.与高脂组小鼠相比,EGCG处理显著降低动物的体重,抑制附睾和肠系膜脂肪组织的累积。第12周时,与高脂组动物相比,EGCG处理组小鼠血糖水平下降22.0%(P酸种类和179种其他脂质种类。与高脂组相比,EGCG处理组显著改变了72种脂质的含量,其中甘油二脂(DG)和甘油三酯(TG)是改变最大的两类物质。EGCG处理组显著降低了高脂饮食诱导的24种DG物种水平的升高。在TG物种中,EGCG显著降低多种多不饱和脂肪酸,升高多种单不饱和脂肪脂肪酸水平。血清中鉴定了共37个游离脂肪酸(FFA)和175种其他脂质种类。EGCG处理组与高脂组相比,显著改变了64种脂质物种的水平,其中游离脂肪酸、磷脂酸胆碱(PC)和甘油二脂是改变最大的三类物质。与高脂组相比,EGCG显著降低血清中总FFA水平,显著增加血清中PC的含量及50%的DG物种水平。3.与高脂组动物相比,EGCG处理组小鼠总胆汁酸池及肠道胆汁酸含量分别降低31.3%和29.1%(P胆汁酸含量显著升高150.0%(P酸吸收相关基因分化抗原簇36(CD36,62.4%,P胆汁酸重吸收,进一步降低了脂质吸收,有助于缓解高脂饮食引起的代谢异常与脂肪肝疾病,为EGCG缓解代谢综合征和脂肪肝发生机制的探讨提了供新的思路。

关键词： EGCG 代谢综合征脂肪肝脂质组学胆汁酸稳态

紧密连接相关蛋白:胆汁淤积性肝损伤治疗的新靶点

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中国药科大学学报 2019年第2期50卷 143-151页

作者：王雪杨婷婷江振洲张陆勇中国药科大学江苏省新药筛选重点实验室南京210009 徐州医科大学江苏省新药研究与临床药学重点实验室徐州221002 广东药科大学药学院新药筛选与药效学评价中心广州510006

胆汁淤积性肝损伤的发生伴随着肝细胞极性的改变和胆汁酸稳态失衡。紧密连接(tight junctions,TJs)结构是存在于上皮细胞之间、维持细胞极性的一种特殊屏障结构,其在维持机体胆汁酸稳态中发挥着重要作用。本文以胆汁淤积性肝损伤为研究... 详细信息

胆汁淤积性肝损伤的发生伴随着肝细胞极性的改变和胆汁酸稳态失衡。紧密连接(tight junctions,TJs)结构是存在于上皮细胞之间、维持细胞极性的一种特殊屏障结构,其在维持机体胆汁酸稳态中发挥着重要作用。本文以胆汁淤积性肝损伤为研究基础,从肝脏和肠道紧密连接结构出发,探讨该结构在胆汁淤积性肝脏疾病中的作用及其分子调控机制,系统介绍以紧密连接相关蛋白为靶点的胆汁淤积性肝脏疾病治疗药物的最新进展,以期寻找与紧密连接结构相关蛋白为靶点的潜在治疗药物。

关键词：胆汁淤积性肝病紧密连接结构屏障功能胆汁酸稳态新药靶点

基于网络药理学的茵陈术附汤抗石胆酸诱导的胆汁淤积性肝损伤作用机制研究

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药学学报 2023年第11期58卷 3366-3378页

作者：章林聪吴家胜田甜李园园王天明马越鸣上海中医药大学中药学院上海201203

茵陈术附汤(Yinchenzhufu decoction,YCZFD)是治疗阴黄证的经典方剂,可改善胆汁淤积性肝损伤,但作用机制尚不完全清楚,本文运用网络药理学、分子对接、动物实验和分子生物学方法,探讨YCZFD抗胆汁淤积性肝损伤机制。采用石胆酸(lithochol... 详细信息

茵陈术附汤(Yinchenzhufu decoction,YCZFD)是治疗阴黄证的经典方剂,可改善胆汁淤积性肝损伤,但作用机制尚不完全清楚,本文运用网络药理学、分子对接、动物实验和分子生物学方法,探讨YCZFD抗胆汁淤积性肝损伤机制。采用石胆酸(lithocholic acid,LCA)诱导的急性胆汁淤积小鼠模型,考察YCZFD给药2周对小鼠肝功能指标及肝脏组织形态学的影响。动物实验经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会批准,伦理编号为:PZSHUTCM190823002。结果显示,YCZFD可降低模型小鼠血生化指标水平,改善肝细胞损伤;运用多个数据库预测YCZFD活性成分与胆汁淤积性肝损伤对应靶点。利用String数据库和Cytoscape软件构建交集靶点PPI网络(protein-protein interaction networks),显示YCZFD抗胆汁淤积性肝损伤可能核心靶点与肿瘤坏死因子、白介素-1β、非受体酪氨酸激酶Src、白介素-6等有关,基于Metascape平台进行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析,发现YCZFD抗胆汁淤积性肝损伤可能与其调节肿瘤坏死因子信号通路、核因子-κB信号通路、胆汁分泌等相关,并运用了AutoDockTools软件对YCZFD影响的核心靶点和核心成分进行分子对接验证。为验证网络药理学结果,采用UPLC-MS/MS方法测定小鼠肝脏中胆汁酸谱水平,显示YCZFD使模型小鼠肝脏中游离胆汁酸、牛磺酸结合型胆汁酸和总胆汁酸水平明显下降;通过real-time PCR和Western blot方法,发现YCZFD干预可上调胆汁淤积小鼠肝脏法尼醇X受体及代谢酶(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1)、外排转运体(胆盐外排泵、多药耐药相关蛋白2、多药耐药相关蛋白3等)表达,促进胆汁酸代谢和外排,改善胆汁酸稳态,抑制NOD样受体家族3活化介导的细胞焦亡及炎症反应,改善胆汁淤积性肝损伤。

关键词：茵陈术附汤石胆酸网络药理学胆汁淤积性肝损伤胆汁酸稳态细胞焦亡

酒精性肝病中基于胆汁酸的调控机制及潜在治疗靶点

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中国医学前沿杂志（电子版） 2023年第2期15卷 58-64页

作者：刘雅丽柳涛赵旭高沿航吉林大学第一医院肝胆胰内科吉林长春130021

胆汁淤积是酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的关键致病因素,不同程度的胆汁淤积发生在ALD的各个阶段。然而,与胆汁淤积有关的病理生理学机制和生物标志物很大程度上是未知的。胆汁淤积主要以胆汁酸(bile acid,BA)转运和平衡紊... 详细信息

胆汁淤积是酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的关键致病因素,不同程度的胆汁淤积发生在ALD的各个阶段。然而,与胆汁淤积有关的病理生理学机制和生物标志物很大程度上是未知的。胆汁淤积主要以胆汁酸(bile acid,BA)转运和平衡紊乱为特点。长期饮酒可以导致人体胆汁酸池大小以及组成异常变化,胆汁酸池的变化也可能影响ALD的严重程度。因此,在ALD的基础和临床研究中,调节胆汁酸代谢及其信号通路被认为是人类ALD的一种潜在治疗策略。本文总结了ALD中基于胆汁酸调节机制的新进展,并提出了ALD各阶段胆汁酸变化不同的新视角,归纳了基于胆汁酸信号通路治疗ALD的潜在靶点,以期为ALD研究和治疗提供新思考。

关键词：胆汁酸稳态酒精性肝病肠道菌群法尼酯X受体肠肝循环成纤维细胞生长因子19

mPEG2k-PCLx聚合物对肝脏摄取转运体OATP和NTCP功能影响的研究

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mPEG2k-PCLx聚合物对肝脏摄取转运体OATP和NTCP功能影响的研究

作者：吴琪华中科技大学

学位级别：硕士

两亲性聚合物胶束因其良好的增溶性、稳定性、靶向性和生物相容性等优势成为目前广泛研究应用的新型药物载体。肝脏上分布的转运体把控着大量底物药物的肝脏摄取,对其处置过程至关重要。聚合物胶束进入体内后主要富集于肝脏,但目前关于... 详细信息

两亲性聚合物胶束因其良好的增溶性、稳定性、靶向性和生物相容性等优势成为目前广泛研究应用的新型药物载体。肝脏上分布的转运体把控着大量底物药物的肝脏摄取,对其处置过程至关重要。聚合物胶束进入体内后主要富集于肝脏,但目前关于聚合物胶束对肝脏摄取转运体影响的研究还非常有限,仍主要集中于外排转运体。已有研究报道聚合物胶束会改变P-糖蛋白(P-gp)的外排功能,其疏水段结构是影响其作用的重要因素之一。本文拟以具相同亲水段(聚乙二醇,PEG),不同分子量疏水段(聚己内酯,PCL)的5种两亲性嵌段聚合物mPEG-PCL为研究对象,考察其在体外、体内对肝脏重要摄取转运体有机阴离子转运多肽(OATP/Oatp)和钠离子/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP/Ntcp)功能的影响并初步探索其机制,为聚合物胶束载药系统的合理设计和安全应用奠定理论基础。首先采用薄膜分散法(mPEG-PCL、mPEG-PCL、mPEG-PCL)和溶剂挥发法(mPEG-PCL、mPEG-PCL)制备聚合物胶束并进行表征。采用芘荧光探针法测定聚合物临界胶束浓度(CMC)值,激光粒度仪测定聚合物胶束粒径大小与Zeta电位,透射电镜(TEM)观察胶束形态,并考察聚合物胶束在不同介质中的稳定性,最后采用小动物活体成像技术观察聚合物胶束在小鼠体内分布情况。结果显示5种聚合物胶束随疏水段分子量增加,CMC值(2.1-1.0μg/m L)逐渐减小,粒径(20 nm-120 nm)逐渐增大,且多分散性良好,TEM下观察胶束呈球形,4℃或37℃下放置48h粒径稳定,5种载Di R的聚合物胶束小鼠尾静脉注射后迅速聚集于肝脏,12 h后达到峰值,与肝脏相比,其他器官分布较少。采用基因转染技术构建稳定高表达人OATP1B1的HEK293细胞,蛋白表达和摄取功能结果显示hOATP1B1-transfected HEK293细胞高表达OATP1B1蛋白,PIT摄取量为vector-transfected HEK293细胞中的2.79倍,表明该细胞中成功转入OATP1B1蛋白基因,可用于OATP1B1功能研究;采用MTT法考察了不同浓度(0.1、1、5、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000μg/mL)聚合物及其胶束对细胞的毒性作用,结果发现除高浓度mPEG-PCL、mPEG-PCL聚合物外,对细胞活性均无明显影响;荧光能量共振转移(FRET)技术考察聚合物胶束的体外稳定性和细胞内完整性结果表明载(DiO+DiI)-聚合物胶束在37℃放置24 h结构稳定;与细胞孵育12 h,细胞内、外胶束结构保持完整。在hOATP1B1-transfected HEK293细胞摄取研究中发现5种聚合物当浓度大于CMC时对OATP1B1摄取功能具有抑制作用。当预孵育时间为1h时,聚合物胶束的抑制作用随PCL段分子量增加先增强后减弱,其中mPEG-PCL聚合物胶束半数抑制浓度(IC)为3.481 mg/m L,抑制作用最强。为了解聚合物胶束在体内对OATP1B1的影响,进一步考察了mPEG-PCL聚合物胶束对大鼠PIT药动学的影响。经尾静脉单次或多次注射mPEG-PCL聚合物胶束后,大鼠灌胃给予PIT,采用LC-MS/MS检测血浆中PIT浓度,结果显示单次或连续多次给药后,试验组PIT药时曲线下面积(AUC)显著增大,而清除率(Cl/F)明显降低,具有统计学意义,推测聚合物胶束可能通过抑制大鼠肝脏Oatps转运体活性,减少肝脏对PIT的摄取,使药物清除变慢或口服药物生物利用度增加,导致血浆中PIT浓度显著升高。采用蛋白免疫印迹(Western blotting)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术考察了大鼠肝脏Oatps、Ntcp及相关转运体蛋白、基因表达的变化,结果显示聚合物胶束对肝脏Oatp1b2、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mrp4蛋白和rOatp1a4、rOatp1b2、rOatp2b1和rNtcp基因表达无明显影响,仅给药7 d组Bsep蛋白和rOatp1a1基因水平显著下降,可能与Oatp功能减弱有关。最后,以hNTCP-transfected HEK293细胞为试验模型,考察了聚合物及其胶束对人NTCP转运体摄取T-CA的影响。结果显示,除mPEG-PCL外,其他4种聚合物均可促进细胞摄取T-CA,且作用随浓度升高、预孵育时间延长而增强,说明聚合物在胶束形式下可影响NTCP活性。由于NTCP底物多为内源性胆汁酸,故进一步以KM小鼠为试验模型考察聚合物胶束对胆汁酸稳态的影响。连续给予5种聚合物胶束7 d后,分别测定血浆中AST、ALT、ALP和总胆汁酸(TBA)含量,肝脏中GSH、ROS、ALP和TBA含量,制备肝脏HE染色切片,并采用LC-MS/MS检测血浆、肝脏和胆汁

关键词：聚合物胶束肝脏转运体 OATPs/Oatps NTCP/Ntcp 药动学胆汁酸稳态