mPEG2k-PCLx聚合物对肝脏摄取转运体OATP和NTCP功能影响的研究

作     者：吴琪 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：斯陆勤

授予年度：2018年

学科分类：100702[医学-药剂学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：聚合物胶束 肝脏转运体 OATPs/Oatps NTCP/Ntcp 药动学 胆汁酸稳态 

摘      要：两亲性聚合物胶束因其良好的增溶性、稳定性、靶向性和生物相容性等优势成为目前广泛研究应用的新型药物载体。肝脏上分布的转运体把控着大量底物药物的肝脏摄取,对其处置过程至关重要。聚合物胶束进入体内后主要富集于肝脏,但目前关于聚合物胶束对肝脏摄取转运体影响的研究还非常有限,仍主要集中于外排转运体。已有研究报道聚合物胶束会改变P-糖蛋白(P-gp)的外排功能,其疏水段结构是影响其作用的重要因素之一。本文拟以具相同亲水段(聚乙二醇,PEG),不同分子量疏水段(聚己内酯,PCL)的5种两亲性嵌段聚合物mPEG-PCL为研究对象,考察其在体外、体内对肝脏重要摄取转运体有机阴离子转运多肽(OATP/Oatp)和钠离子/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP/Ntcp)功能的影响并初步探索其机制,为聚合物胶束载药系统的合理设计和安全应用奠定理论基础。首先采用薄膜分散法(mPEG-PCL、mPEG-PCL、mPEG-PCL)和溶剂挥发法(mPEG-PCL、mPEG-PCL)制备聚合物胶束并进行表征。采用芘荧光探针法测定聚合物临界胶束浓度(CMC)值,激光粒度仪测定聚合物胶束粒径大小与Zeta电位,透射电镜(TEM)观察胶束形态,并考察聚合物胶束在不同介质中的稳定性,最后采用小动物活体成像技术观察聚合物胶束在小鼠体内分布情况。结果显示5种聚合物胶束随疏水段分子量增加,CMC值(2.1-1.0μg/m L)逐渐减小,粒径(20 nm-120 nm)逐渐增大,且多分散性良好,TEM下观察胶束呈球形,4℃或37℃下放置48h粒径稳定,5种载Di R的聚合物胶束小鼠尾静脉注射后迅速聚集于肝脏,12 h后达到峰值,与肝脏相比,其他器官分布较少。采用基因转染技术构建稳定高表达人OATP1B1的HEK293细胞,蛋白表达和摄取功能结果显示hOATP1B1-transfected HEK293细胞高表达OATP1B1蛋白,PIT摄取量为vector-transfected HEK293细胞中的2.79倍,表明该细胞中成功转入OATP1B1蛋白基因,可用于OATP1B1功能研究;采用MTT法考察了不同浓度(0.1、1、5、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000μg/mL)聚合物及其胶束对细胞的毒性作用,结果发现除高浓度mPEG-PCL、mPEG-PCL聚合物外,对细胞活性均无明显影响;荧光能量共振转移(FRET)技术考察聚合物胶束的体外稳定性和细胞内完整性结果表明载(DiO+DiI)-聚合物胶束在37℃放置24 h结构稳定;与细胞孵育12 h,细胞内、外胶束结构保持完整。在hOATP1B1-transfected HEK293细胞摄取研究中发现5种聚合物当浓度大于CMC时对OATP1B1摄取功能具有抑制作用。当预孵育时间为1h时,聚合物胶束的抑制作用随PCL段分子量增加先增强后减弱,其中mPEG-PCL聚合物胶束半数抑制浓度(IC)为3.481 mg/m L,抑制作用最强。为了解聚合物胶束在体内对OATP1B1的影响,进一步考察了mPEG-PCL聚合物胶束对大鼠PIT药动学的影响。经尾静脉单次或多次注射mPEG-PCL聚合物胶束后,大鼠灌胃给予PIT,采用LC-MS/MS检测血浆中PIT浓度,结果显示单次或连续多次给药后,试验组PIT药时曲线下面积(AUC)显著增大,而清除率(Cl/F)明显降低,具有统计学意义,推测聚合物胶束可能通过抑制大鼠肝脏Oatps转运体活性,减少肝脏对PIT的摄取,使药物清除变慢或口服药物生物利用度增加,导致血浆中PIT浓度显著升高。采用蛋白免疫印迹(Western blotting)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术考察了大鼠肝脏Oatps、Ntcp及相关转运体蛋白、基因表达的变化,结果显示聚合物胶束对肝脏Oatp1b2、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mrp4蛋白和rOatp1a4、rOatp1b2、rOatp2b1和rNtcp基因表达无明显影响,仅给药7 d组Bsep蛋白和rOatp1a1基因水平显著下降,可能与Oatp功能减弱有关。最后,以hNTCP-transfected HEK293细胞为试验模型,考察了聚合物及其胶束对人NTCP转运体摄取T-CA的影响。结果显示,除mPEG-PCL外,其他4种聚合物均可促进细胞摄取T-CA,且作用随浓度升高、预孵育时间延长而增强,说明聚合物在胶束形式下可影响NTCP活性。由于NTCP底物多为内源性胆汁酸,故进一步以KM小鼠为试验模型考察聚合物胶束对胆汁酸稳态的影响。连续给予5种聚合物胶束7 d后,分别测定血浆中AST、ALT、ALP和总胆汁酸(TBA)含量,肝脏中GSH、ROS、ALP和TBA含量,制备肝脏HE染色切片,并采用LC-MS/MS检测血浆、肝脏和胆汁