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粉尘螨变应原点刺液在皮肤点刺试验中的应用价值

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临床检验杂志 2022年第8期40卷 561-566页

作者：汤蕊吕晓虹刘禹希王瑞琦王良录李宏孙劲旅顾建青关凯支玉香文利平王子熹崔乐李丽莎徐迎阳周俊雄徐涛尹佳中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院变态(过敏)反应科过敏性疾病精准诊疗研究北京市重点实验室国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心北京100730 中国医学科学院北京协和医学院北京100730 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院统计学教研室北京100730

目的评估北京协和医院(PUMCH)粉尘螨变应原点刺液在使用皮肤点刺试验(SPT)方法诊断粉尘螨过敏症中的准确性和安全性。方法连续纳入2015年8月10日至2017年8月30日在PUMCH变态(过敏)反应科门诊确诊变应性疾病的910例受试者。使用PUMCH粉... 详细信息

目的评估北京协和医院(PUMCH)粉尘螨变应原点刺液在使用皮肤点刺试验(SPT)方法诊断粉尘螨过敏症中的准确性和安全性。方法连续纳入2015年8月10日至2017年8月30日在PUMCH变态(过敏)反应科门诊确诊变应性疾病的910例受试者。使用PUMCH粉尘螨变应原点刺液对所有受试者进行SPT,用荧光酶联免疫方法检测血清粉尘螨特异性免疫球蛋白E(sIgE)。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析诊断准确性,诊断金标准为sIgE阳性。同时对不同诊断切点的准确性进行分析。该点刺液的安全性通过记录患者不良反应实现。结果本研究无脱落病例。全分析集(FAS)、符合方案集(PPS)、安全集(SS)分别为871例、670例和910例。ROC曲线下面积分别为0.902(FAS)和0.915(PPS)。在PPS中,使用点刺液诊断粉尘螨过敏的最佳诊断切点为平均风团直径3.25 mm,敏感性为85.77%(95%置信区间:82.71%~88.84%),特异性为86.55%(95%置信区间:81.44%~91.66%)。95%特异性的诊断切点为平均风团直径4.25 mm。SS中未有不良反应事件发生。结论PUMCH粉尘螨变应原点刺液在SPT中具有较高的敏感性和特异性,且安全性高,对粉尘螨过敏症的诊断具有较高的应用价值。

关键词：皮肤点刺试验变应原点刺液粉尘螨免疫球蛋白E

粉尘螨过敏患者Der f 1和Der f 2特异性IgE的检测分析

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厦门大学学报（自然科学版） 2017年第1期56卷 137-141页

作者：董劲春程浩浙江大学医学院附属邵逸夫医院浙江杭州310016

为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本... 详细信息

为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本,进一步检测其粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平.80例样本中2种方法检测粉尘螨均为阳性的有65例,阳性率为81.3%.65例阳性样本中,Der f 1阳性率为87.7%,Der f 2阳性率为90.8%,二者至少一个为阳性的达96.99%,Der f 2特异性IgE水平显著高于Der f 1.儿童的粉尘螨及其2种单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平显著高于成人.综上,Der f 1和Der f 2这2种组分过敏原在我国粉尘螨患者中占据了主导地位,两者特异性IgE水平存在显著差异,后者高于前者,且儿童的敏感性显著高于成人.

关键词：粉尘螨过敏原 Derf1 Derf2

粉尘螨重组过敏原Der f 11(副肌球蛋白)克隆表达、纯化及免疫学鉴定

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中国免疫学杂志 2014年第6期30卷 736-740页

作者：蒋聪利邬玉兰幸鹏杨平常刘志刚深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所深圳518060

目的:克隆粉尘螨过敏原Der f 11基因,表达、纯化该蛋白,并鉴定其免疫活性。方法:人工合成粉尘螨第11组过敏原Der f 11基因,将其连接至pET-32a表达载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过Ni+亲和层析纯化重组过敏原Der f... 详细信息

目的:克隆粉尘螨过敏原Der f 11基因,表达、纯化该蛋白,并鉴定其免疫活性。方法:人工合成粉尘螨第11组过敏原Der f 11基因,将其连接至pET-32a表达载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过Ni+亲和层析纯化重组过敏原Der f 11。以粉尘螨过敏患者血清作为一抗,经Western blot方法分析Der f 11的免疫学特性。结果:获得高纯度的重组Der f 11蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物pET-32a(+)-Der f 11分子质量约为118 ku。重组过敏原Der f 11检测15份尘螨过敏性患者血清中特异性IgE,阳性率为20%。结论:获得的Der f 11重组蛋白具有与天然蛋白相似的免疫学活性,为标准化抗原的临床特异性诊断和治疗及进一步的实验研究奠定基础。

关键词：粉尘螨重组Deft 11 表达 Western blot IgE

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粉尘螨3类变应原的T细胞表位预测及鉴定

中国血吸虫病防治杂志 2014年第4期26卷 415-419页

作者：李娜李朝品刁吉东赵蓓蓓姜玉新皖南医学院医学寄生虫学教研室芜湖241002 皖南医学院生理学教研室

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)的T细胞表位。方法运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T细胞抗原表位,并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法,用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴细胞增殖试验;酶联免疫吸附... 详细信息

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)的T细胞表位。方法运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T细胞抗原表位,并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法,用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴细胞增殖试验;酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4及IL-5水平。结果成功预测了Der f 3的5个T细胞表位肽,通过脾淋巴细胞增殖试验,其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并刺激细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,抑制细胞因子IL-4和IL-5的分泌。其序列分别为37GDCPYQISLQSSSHFCGG54、98IYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123和164SELQRVDIDVVSREQCDQLYS184。结论初步鉴定了Der f 3变应原中3个T细胞表位序列,为后续过敏性哮喘的诊断和特异性免疫治疗奠定基础。

关键词：粉尘螨粉尘螨3类变应原 T细胞表位表位预测脾淋巴细胞增殖试验

粉尘螨3类变应原的B细胞线性表位预测及鉴定

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中国血吸虫病防治杂志 2014年第3期26卷 296-299,307页

作者：李娜李朝品刁吉东赵蓓蓓陆维姜玉新皖南医学院医学寄生虫学教研室芜湖241002 皖南医学院弋矶山医院呼吸内科皖南医学院生理学教研室

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由1... 详细信息

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用,明确其中的强阳性表位肽序列。结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中,在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列,为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。

关键词：粉尘螨粉尘螨3类变应原 B细胞表位表位预测鉴定

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粉尘螨多态性微卫星标记的开发与评价

皖南医学院学报 2022年第6期41卷 598-601页

作者：王慧慧方惟希王铎刘艺李咏琪李幸蓉陈子健叶长江孙恩涛皖南医学院临床医学院安徽芜湖241002 皖南医学院检验学院安徽芜湖241002

目的:开发粉尘螨基因组微卫星标记,为粉尘螨种群遗传多态性和遗传分化提供有效的分子标记。方法:基于Illumina HiSeq TM平台进行粉尘螨全基因组测序,用MISA识别微卫星序列,Primer5设计引物,并进行PCR扩增。选择易扩增、稳定性高的引物,... 详细信息

目的:开发粉尘螨基因组微卫星标记,为粉尘螨种群遗传多态性和遗传分化提供有效的分子标记。方法:基于Illumina HiSeq TM平台进行粉尘螨全基因组测序,用MISA识别微卫星序列,Primer5设计引物,并进行PCR扩增。选择易扩增、稳定性高的引物,应用毛细管电泳法对3个种群共15个个体进行遗传多样性分析,以评价所开发微卫星标记的效果。结果:在粉尘螨基因组中筛选到266个候选微卫星标记,通过毛细管电泳再筛选得到12对微卫星标记。用12对引物对3个种群共15个个体进行遗传多样性分析。结果表明,12个标记共有66个等位基因,每个标记等位基因数为3~9,观测杂合度和期望杂合度分别为0.133~0.800和0.291~0.793。各标记的香农指数I为0.563~1.807。各标记的多态性信息含量PIC为0.271~0.765,8个位点为高度多态性标记,其余为中度多态性标记。结论:本研究开发出的微卫星标记准确可靠,多态性高,可应用于粉尘螨的遗传多样性分析。

关键词：粉尘螨微卫星分子标记遗传多样性

石菖蒲提取物有效成分分析及对粉尘螨杀灭活性机制研究

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石菖蒲提取物有效成分分析及对粉尘螨杀灭活性机制研究

作者：汪梅青皖南医学院

学位级别：硕士

目的:了解土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物对粉尘螨的杀灭活性,并探究其杀螨机制。以开发出对人体无毒害作用并且杀螨效果良好的植物源性杀螨剂。方法:选取土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的... 详细信息

目的:了解土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物对粉尘螨的杀灭活性,并探究其杀螨机制。以开发出对人体无毒害作用并且杀螨效果良好的植物源性杀螨剂。方法:选取土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物进行杀螨试验。选取效果最好的石菖蒲精油进行分离鉴定,使用高效液相色谱(HPLC)仪,经正向硅胶柱中压制备,收集其中各个组分。对分离出的不同成分进行杀螨活性对比。对杀螨效果良好的成分进行质谱和一氢核磁共振(H-NMR)、碳13核磁共振(C-NMR)图谱分析,鉴定其成分。将有效成分与市面上常用的4种植物源性杀螨剂和5种化学杀螨剂进行杀螨活性对比,以探究其实际应用价值。研究有效成分对粉尘螨在基因转录组学方面造成的影响,初步探究其杀螨机制。结果:(1)土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物均对粉尘螨有良好的杀灭活性,当浓度为1%时24小时校正死亡率均大于85%。其中石菖蒲提取物杀螨效力最强,稀释至0.125%时对粉尘螨24小时校正死亡率100%,稀释至0.0625%浓度时对粉尘螨24小时校正死亡率可达94.33%。(2)对石菖蒲精油进行分离鉴定,分离出A-F六个组分,对分离出的不同成分进行杀螨活性对比,发现D、E组分杀螨效果良好,D组分稀释至0.25%时粉尘螨全部死亡,稀释至0.125%浓度时粉尘螨24小时校正死亡率可达93.67%左右,E组分稀释至0.0625%时粉尘螨全部死亡,稀释至0.03125%浓度时粉尘螨24小时校正死亡率为82.67%左右。通过对D、E组分进行质谱和H-NMR、C-NMR图谱分析,鉴定得D组分为异丁香酚甲醚,E组分为β-细辛脑,β-细辛脑对人体具有毒性,因此不作为后续研究对象。(3)异丁香酚甲醚与市面上常用的4种植物源性杀螨剂和5种化学杀螨剂进行杀螨活性对比,结果表明其杀螨活性优于鱼藤酮、苦皮藤素、苦参碱、阿维菌素、丙溴·辛硫磷,炔螨特、螺螨酯、哒螨灵,略低于印楝素。(4)使用异丁香酚甲醚处理粉尘螨,通过差异基因统计分析,对照组和处理组比较,差异表达基因总数1945个,其中上调基因数986个,如:鞘磷脂、水解酶、神经鞘磷脂磷酸二脂酶等,下调基因数959个,如:己糖基转移酶、半胱氨酸型内肽酶抑制剂、葡糖神经酰胺酶等。对差异基因进行GO富集分析,发现其主要影响粉尘螨的离子转运、蛋白质水解、几丁质结合、碳水化合物代谢过程及丝氨酸-型内肽酶活性。对差异基因进行KEGG富集,发现其主要富集的通路有:胰液分泌通路、脂肪的消化与吸收通路、抗原加工提呈通路、淀粉和蔗糖代谢通路、其他聚糖降解通路、溶酶体通路。分析发现其杀螨机制可能是影响了粉尘螨的钾离子转运,并且作用于粉尘螨的神经系统致其死亡。从鉴定出的差异基因中筛选出13个基因,采用RT-q PCR技术对用药后的粉尘螨的m RNA表达情况进行荧光定量分析,结果显示以上基因的表达量均发生了显著变化,说明这些基因在粉尘螨的调控方面发挥了重要作用。结论:本研究发现石菖蒲根茎提取物对粉尘螨具有良好的杀灭活性,分离出的异丁香酚甲醚和β-细辛脑为主要作用成分。异丁香酚甲醚对人体和环境无不良影响,可作为良好的杀螨剂应用于实际。其效果优于市面上大部分常用的植物源性和化学性杀螨剂。通过转录组学分析发现其杀螨机制可能是影响了粉尘螨的钾离子转运,并且作用于粉尘螨的神经系统致其死亡。

关键词：石菖蒲粉尘螨杀螨活性异丁香酚甲醚转录组学

粉尘螨Hsp60基因的测序、克隆和原核表达

同方学位论文库评论

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中国人兽共患病学报 2015年第2期31卷 154-157页

作者：刘海娟洪青罗晓东李小敏丁雪沈浩贤陈代雄广州医科大学病原生物学与免疫学教研室广州510182

目的探索和发现粉尘螨新的变应原组分。方法以粉尘螨热休克蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)为研究对象,用简并引物PCR方法扩增出其cDNA片段,并对该片段进行了序列测定和分析。同时,对该基因片段进行了克隆、原核表达。结果与结论... 详细信息

目的探索和发现粉尘螨新的变应原组分。方法以粉尘螨热休克蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)为研究对象,用简并引物PCR方法扩增出其cDNA片段,并对该片段进行了序列测定和分析。同时,对该基因片段进行了克隆、原核表达。结果与结论成功确定粉尘螨Hsp60基因片段cDNA序列;构建了pET-28a(+)-Hsp60重组质粒,并在E.coli BL21中得到高效表达。

关键词：粉尘螨 Hsp60 基因序列原核表达

粉尘螨新过敏原初筛及其Der f23蛋白结构解析

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粉尘螨新过敏原初筛及其Der f23蛋白结构解析

作者：胡葭耘深圳大学

学位级别：硕士

尘螨是世界上分布最广泛的过敏原,与哮喘的发生高度相关,是世界性的最主要过敏原。粉尘螨(Dermatophagoides farinae,Der f)是我国诱导尘螨过敏反应的主要物种。目前已分离鉴定了37种粉尘螨过敏原组分,均为蛋白质。课题组完成了粉尘螨... 详细信息

尘螨是世界上分布最广泛的过敏原,与哮喘的发生高度相关,是世界性的最主要过敏原。粉尘螨(Dermatophagoides farinae,Der f)是我国诱导尘螨过敏反应的主要物种。目前已分离鉴定了37种粉尘螨过敏原组分,均为蛋白质。课题组完成了粉尘螨的二代基因组和转录组测序及其图谱初步组装,并发现了一种新的过敏原,泛醌细胞色素C还原酶结合蛋白(Ubiquinol-cytochrome C reductase binding protein,UQCRB)同源物,命名为Der f24。但是,粉尘螨肠道中拥有丰富的微生物菌群,这影响着粉尘螨基因组提取的纯度。从而需要一种减少微生物菌群数量的基因组提取方法提高粉尘螨基因组图谱组装的质量。另外,利用新型方法筛选粉尘螨新过敏原组分对于尘螨过敏性疾病的病理认识,疾病诊断与治疗有着实质性的指导意义。研究发现Der p23是继Der p1和Der p2后的又一个尘螨主要过敏原,通过结晶已解析Der p1,2蛋白结构,临床上更多针对主要过敏原进行药物研发。课题组发现Der f23与Der p23同样具有较强的过敏原性,通过解析蛋白结构可加深对主要过敏原的认识并为开发尘螨疫苗提供思路。目的:1.建立高纯度的粉尘螨基因组提取方法:分离提取粉尘螨虫卵进行DNA测序;比较粉尘螨虫卵和粉尘螨的微生物数量、含量、种类的差异;粉尘螨转录组第三代DNA测序;2.筛选粉尘螨新过敏原组分:建立粉尘螨cDNA文库;与WHO/IUIS过敏原命名数据库同源比对筛选;原核表达系统表达纯化重组蛋白与过敏原性鉴定;3.Der f23蛋白结构解析:重组蛋白结晶探索与其结构解析。方法:1.粉尘螨物种的人工纯化培养,分离豆粉培养基,虫卵,粉尘螨虫体;PCR鉴定粉尘螨物种;2.分离好的粉尘螨提取RNA,反转录成cDNA,检测cDNA质量,;3.粉尘螨虫卵基因组测序;4.随机选取各100万条(1MB)粉尘螨虫卵基因组和粉尘螨基因组序列,与NCBI的nt数据库比对,分析两个基因组之间的微生物含量差异;5.粉尘螨转录组与WHO/IUIS过敏原数据库根据设定条件比对,筛选符合条件的粉尘螨转录组序列;6.符合条件的DNA序列从cDNA库中提取,表达纯化,WB和ELISA鉴定新过敏原;7.Der f23蛋白表达纯化,探索结晶条件,分析晶体统计数据。结果:1.成功地建立高纯度的粉尘螨基因组提取方法:(1).套式PCR鉴定人工培养的粉尘螨为纯种粉尘螨,无屋尘螨污染,并且分离后的粉尘螨DNA中无豆粉DNA污染;(2).成功分离粉尘螨和粉尘螨虫卵,粉尘螨虫卵提取DNA测序初步拼接后得到79MB大小基因组;(3).粉尘螨基因组中细菌占22.62%,主要是变形菌(19.24%),拟杆菌(2.31%),硬壁菌(0.78%),真核类生物占76.90%,主要是节肢动物门(52.83%),脊索动物门(5.74%),线虫类(4.51%)等;粉尘螨虫卵基因组中细菌占1.55%,主要是变形菌(0.58%),拟杆菌(0.63%),硬壁菌(0.18%),真核生物占98.34%,主要是节肢动物门(69.55%),脊索动物门(6.99%),线虫类(5.66%)等,总体粉尘螨虫卵基因组比粉尘螨基因组中细菌含量下降93%,真核生物含量提升27%;2.同源比对方法筛选粉尘螨新过敏原组分:(1).成功提取粉尘螨RNA并反转录成cDNA,cDNA质量经琼脂糖凝胶电泳和Agilent测定合格,建立了粉尘螨cDNA文库;(2).粉尘螨转录组与WHO/IUIS过敏原数据库比对得到31条DNA序列,从中筛选出11条与IgE反应强的序列;(3).根据11个潜在过敏原DNA序列设计特异性引物,成功从粉尘螨cDNA文库中扩增出6个基因,经过原核表达系统表达与纯化重组蛋白;(4).免疫印迹、点杂交和ELISA的特异性IgE结合活性测定,初步鉴定出一个粉尘螨新过敏原;3.Der f23蛋白结构解析:(1).经多个结晶条件筛选出了PEG/ION 44(0.2M MgCl,0.1 NaCHO·2HO pH 5.0,2%PEG 2000)的最佳结晶条件;(2).Der f 23的C端(PCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT)生长成蛋白晶体(PDB登录号:5ZJL),分辨率1.7?,大小0.2 mm×0.1 mm×0.1 mm,含两个β片层和一个α结构。结论:1.粉尘螨虫卵中细菌含量极低,相比粉尘螨基因组细菌含量降低90%以上;2.运用生物信息技术初步筛选鉴定出一个粉尘螨新过敏原;3.初步解析Der f23蛋白结构。

关键词：粉尘螨虫卵基因组过敏原 Derf23 晶体