粉尘螨新过敏原初筛及其Der f23蛋白结构解析
作者单位：深圳大学
学位级别：硕士
导师姓名：吉坤美
授予年度：2018年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学]
摘 要：尘螨是世界上分布最广泛的过敏原,与哮喘的发生高度相关,是世界性的最主要过敏原。粉尘螨(Dermatophagoides farinae,Der f)是我国诱导尘螨过敏反应的主要物种。目前已分离鉴定了37种粉尘螨过敏原组分,均为蛋白质。课题组完成了粉尘螨的二代基因组和转录组测序及其图谱初步组装,并发现了一种新的过敏原,泛醌细胞色素C还原酶结合蛋白(Ubiquinol-cytochrome C reductase binding protein,UQCRB)同源物,命名为Der f24。但是,粉尘螨肠道中拥有丰富的微生物菌群,这影响着粉尘螨基因组提取的纯度。从而需要一种减少微生物菌群数量的基因组提取方法提高粉尘螨基因组图谱组装的质量。另外,利用新型方法筛选粉尘螨新过敏原组分对于尘螨过敏性疾病的病理认识,疾病诊断与治疗有着实质性的指导意义。研究发现Der p23是继Der p1和Der p2后的又一个尘螨主要过敏原,通过结晶已解析Der p1,2蛋白结构,临床上更多针对主要过敏原进行药物研发。课题组发现Der f23与Der p23同样具有较强的过敏原性,通过解析蛋白结构可加深对主要过敏原的认识并为开发尘螨疫苗提供思路。目的:1.建立高纯度的粉尘螨基因组提取方法:分离提取粉尘螨虫卵进行DNA测序;比较粉尘螨虫卵和粉尘螨的微生物数量、含量、种类的差异;粉尘螨转录组第三代DNA测序;2.筛选粉尘螨新过敏原组分:建立粉尘螨cDNA文库;与WHO/IUIS过敏原命名数据库同源比对筛选;原核表达系统表达纯化重组蛋白与过敏原性鉴定;3.Der f23蛋白结构解析:重组蛋白结晶探索与其结构解析。方法:1.粉尘螨物种的人工纯化培养,分离豆粉培养基,虫卵,粉尘螨虫体;PCR鉴定粉尘螨物种;2.分离好的粉尘螨提取RNA,反转录成cDNA,检测cDNA质量,;3.粉尘螨虫卵基因组测序;4.随机选取各100万条(1MB)粉尘螨虫卵基因组和粉尘螨基因组序列,与NCBI的nt数据库比对,分析两个基因组之间的微生物含量差异;5.粉尘螨转录组与WHO/IUIS过敏原数据库根据设定条件比对,筛选符合条件的粉尘螨转录组序列;6.符合条件的DNA序列从cDNA库中提取,表达纯化,WB和ELISA鉴定新过敏原;7.Der f23蛋白表达纯化,探索结晶条件,分析晶体统计数据。结果:1.成功地建立高纯度的粉尘螨基因组提取方法:(1).套式PCR鉴定人工培养的粉尘螨为纯种粉尘螨,无屋尘螨污染,并且分离后的粉尘螨DNA中无豆粉DNA污染;(2).成功分离粉尘螨和粉尘螨虫卵,粉尘螨虫卵提取DNA测序初步拼接后得到79MB大小基因组;(3).粉尘螨基因组中细菌占22.62%,主要是变形菌(19.24%),拟杆菌(2.31%),硬壁菌(0.78%),真核类生物占76.90%,主要是节肢动物门(52.83%),脊索动物门(5.74%),线虫类(4.51%)等;粉尘螨虫卵基因组中细菌占1.55%,主要是变形菌(0.58%),拟杆菌(0.63%),硬壁菌(0.18%),真核生物占98.34%,主要是节肢动物门(69.55%),脊索动物门(6.99%),线虫类(5.66%)等,总体粉尘螨虫卵基因组比粉尘螨基因组中细菌含量下降93%,真核生物含量提升27%;2.同源比对方法筛选粉尘螨新过敏原组分:(1).成功提取粉尘螨RNA并反转录成cDNA,cDNA质量经琼脂糖凝胶电泳和Agilent测定合格,建立了粉尘螨cDNA文库;(2).粉尘螨转录组与WHO/IUIS过敏原数据库比对得到31条DNA序列,从中筛选出11条与IgE反应强的序列;(3).根据11个潜在过敏原DNA序列设计特异性引物,成功从粉尘螨cDNA文库中扩增出6个基因,经过原核表达系统表达与纯化重组蛋白;(4).免疫印迹、点杂交和ELISA的特异性IgE结合活性测定,初步鉴定出一个粉尘螨新过敏原;3.Der f23蛋白结构解析:(1).经多个结晶条件筛选出了PEG/ION 44(0.2M MgCl,0.1 NaCHO·2HO pH 5.0,2%PEG 2000)的最佳结晶条件;(2).Der f 23的C端(PCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT)生长成蛋白晶体(PDB登录号:5ZJL),分辨率1.7?,大小0.2 mm×0.1 mm×0.1 mm,含两个β片层和一个α结构。结论:1.粉尘螨虫卵中细菌含量极低,相比粉尘螨基因组细菌含量降低90%以上;2.运用生物信息技术初步筛选鉴定出一个粉尘螨新过敏原;3.初步解析Der f23蛋白结构。
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