石菖蒲提取物有效成分分析及对粉尘螨杀灭活性机制研究

作     者：汪梅青 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：湛孝东

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：石菖蒲 粉尘螨 杀螨活性 异丁香酚甲醚 转录组学 

摘      要：目的:了解土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物对粉尘螨的杀灭活性,并探究其杀螨机制。以开发出对人体无毒害作用并且杀螨效果良好的植物源性杀螨剂。方法:选取土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物进行杀螨试验。选取效果最好的石菖蒲精油进行分离鉴定,使用高效液相色谱(HPLC)仪,经正向硅胶柱中压制备,收集其中各个组分。对分离出的不同成分进行杀螨活性对比。对杀螨效果良好的成分进行质谱和一氢核磁共振(H-NMR)、碳13核磁共振(C-NMR)图谱分析,鉴定其成分。将有效成分与市面上常用的4种植物源性杀螨剂和5种化学杀螨剂进行杀螨活性对比,以探究其实际应用价值。研究有效成分对粉尘螨在基因转录组学方面造成的影响,初步探究其杀螨机制。结果:(1)土木香、山苍子、藿香、大风子、石菖蒲五种中草药的提取物均对粉尘螨有良好的杀灭活性,当浓度为1%时24小时校正死亡率均大于85%。其中石菖蒲提取物杀螨效力最强,稀释至0.125%时对粉尘螨24小时校正死亡率100%,稀释至0.0625%浓度时对粉尘螨24小时校正死亡率可达94.33%。(2)对石菖蒲精油进行分离鉴定,分离出A-F六个组分,对分离出的不同成分进行杀螨活性对比,发现D、E组分杀螨效果良好,D组分稀释至0.25%时粉尘螨全部死亡,稀释至0.125%浓度时粉尘螨24小时校正死亡率可达93.67%左右,E组分稀释至0.0625%时粉尘螨全部死亡,稀释至0.03125%浓度时粉尘螨24小时校正死亡率为82.67%左右。通过对D、E组分进行质谱和H-NMR、C-NMR图谱分析,鉴定得D组分为异丁香酚甲醚,E组分为β-细辛脑,β-细辛脑对人体具有毒性,因此不作为后续研究对象。(3)异丁香酚甲醚与市面上常用的4种植物源性杀螨剂和5种化学杀螨剂进行杀螨活性对比,结果表明其杀螨活性优于鱼藤酮、苦皮藤素、苦参碱、阿维菌素、丙溴·辛硫磷,炔螨特、螺螨酯、哒螨灵,略低于印楝素。(4)使用异丁香酚甲醚处理粉尘螨,通过差异基因统计分析,对照组和处理组比较,差异表达基因总数1945个,其中上调基因数986个,如:鞘磷脂、水解酶、神经鞘磷脂磷酸二脂酶等,下调基因数959个,如:己糖基转移酶、半胱氨酸型内肽酶抑制剂、葡糖神经酰胺酶等。对差异基因进行GO富集分析,发现其主要影响粉尘螨的离子转运、蛋白质水解、几丁质结合、碳水化合物代谢过程及丝氨酸-型内肽酶活性。对差异基因进行KEGG富集,发现其主要富集的通路有:胰液分泌通路、脂肪的消化与吸收通路、抗原加工提呈通路、淀粉和蔗糖代谢通路、其他聚糖降解通路、溶酶体通路。分析发现其杀螨机制可能是影响了粉尘螨的钾离子转运,并且作用于粉尘螨的神经系统致其死亡。从鉴定出的差异基因中筛选出13个基因,采用RT-q PCR技术对用药后的粉尘螨的m RNA表达情况进行荧光定量分析,结果显示以上基因的表达量均发生了显著变化,说明这些基因在粉尘螨的调控方面发挥了重要作用。结论:本研究发现石菖蒲根茎提取物对粉尘螨具有良好的杀灭活性,分离出的异丁香酚甲醚和β-细辛脑为主要作用成分。异丁香酚甲醚对人体和环境无不良影响,可作为良好的杀螨剂应用于实际。其效果优于市面上大部分常用的植物源性和化学性杀螨剂。通过转录组学分析发现其杀螨机制可能是影响了粉尘螨的钾离子转运,并且作用于粉尘螨的神经系统致其死亡。