粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达

作     者：王楠 滕飞翔 俞黎黎 杨李 张承伯 周鹰 崔玉宝 WANG Nan;TENG Fei-xiang;YU Li-li;YANG Li;ZHANG Cheng-bo;ZHOU Ying;CUI Yu-bao

作者机构：盐城卫生职业技术学院盐城224006 东南大学医学院附属盐城医院盐城224006 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2017年第35卷第4期

页      面：351-356页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(No.NSFC31272369 NSFC81001330 NSFC30060166 NSFC31572319) 江苏省卫生厅招标项目(No.Z200914) 江苏省卫生职业技术教育研究立项课题(No.J200907)~~ 

主　　题：粉尘螨 变应原 基因克隆 基因表达 生物信息学 

摘      要：目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。